HPLC测定冬凌草中迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素的含量

[摘要]建立同时测定冬凌草药材中迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素含量的高效液相色谱方法。采用Ultimate C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长338，242 nm。迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素的线性范围分别为0.222～2.78，0.227～2.84，0.005 68～0.071 μg；平均加样回收率分别为102.9%（RSD 1.9%），99.6%（RSD 1.1%），102.5%（RSD 0.94%） 。该方法简便、准确，重复性好，可用于冬凌草药材的质量控制。

[关键词]冬凌草；迷迭香酸；冬凌草甲素；猫眼草黄素；含量测定；高效液相色谱法

冬凌草，又名冰凌花，为唇形科香茶菜属植物碎米桠Isodon rubescens （Hemsl.） Hara的干燥地上部分。主产于河南，在河北、山西、甘肃、四川、贵州、湖南、湖北、广西、江西、安徽、浙江等地均有分布[1]。冬凌草历代本草未见收载。20世纪70年代，发现在河南民间曾用全草治疗食道癌，后经研究证明冬凌草水及醇提物对Hela细胞及食管癌细胞株有明显的细胞毒作用，对多种移植性肿瘤有抗癌作用。现代药理研究表明冬凌草具有良好的抗肿瘤、抗菌、抗炎、免疫增强等作用[2-5]。冬凌草主要含有二萜类、黄酮类、酚酸类及三萜类等成分，其中黄酮类成分是冬凌草中仅次于二萜类的一类成分，大量研究表明黄酮类成分具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等活性[6]，与冬凌草的功效具有密切的相关性，因此有必要增加特征性成分猫眼草黄素的含量测定。到目前为止，未见文献报道采用HPLC法测定冬凌草中黄酮类成分的含量。2010年版《中国药典》冬凌草项下仅收载了冬凌草甲素的含量测定，相关文献报道了冬凌草中迷迭香酸、冬凌草甲素、齐墩果酸等成分的含量测定方法[7-8]，但仍缺乏以黄酮类成分为指标评价冬凌草药材质量的方法。因此，本文在冬凌草化学成分研究的基础上，建立了HPLC同时测定冬凌草中迷迭香酸、冬凌草甲素、猫眼草黄素3种成分含量的方法，为评价冬凌草药材的质量提供参考。

1 材料

岛津LC-20AT高效液相色谱系统，包括四元梯度洗脱泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器（日本岛津公司），Agilent 6130 SQ-MSD质谱仪（美国Agilent公司），Bruker Avance 600核磁共振波谱仪（德国Bruker公司），KQ-250DBX型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），XS105型1/10万电子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）。

HPD100大孔吸附树脂（沧州宝恩化工有限公司），薄层硅胶GF254和柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司），提取分离用乙醇、氯仿和甲醇均为分析纯。含量测定用甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，甲酸为分析纯。

迷迭香酸（批号111871-201001）对照品购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用。冬凌草甲素和猫眼草黄素对照品为作者自行分离纯化，并经MS，NMR鉴定结构，HPLC检测，面积归一化法计算纯度均大于98%。

分离用冬凌草药材采自河南济源。分析用冬凌草药材采自河南济源、购自河南郑州张仲景大药房和河南郑州东升医药商店，经中国中医科学院中药研究所王智民研究员鉴定为唇形科香茶菜属植物碎米桠I. rubescens的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 冬凌草甲素、猫眼草黄素对照品的制备

冬凌草地上部分（12 kg），切段，用70%乙醇提取3次（72，60，60 L），提取液合并，减压回收溶剂至无醇味，静置，过滤。滤液经大孔吸附树脂柱色谱分离，以水-乙醇梯度洗脱，得到3个部位（I～III）。部位I（11.8 g）经硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮（9∶1～85∶15）梯度洗脱，分为4个组分（Fr. A1～Fr. A4）。组分Fr. A3经Sephadex LH-20柱色谱（氯仿-甲醇1∶1洗脱）纯化，得到化合物1（120 mg）。从部位II中取100 g经硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇（95∶5～2∶8）梯度洗脱，得到64个流分。流分8（2.65 g）经硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇（50∶1）洗脱，得到化合物2（570 mg）。

2.2 冬凌草甲素、猫眼草黄素对照品的结构鉴定

化合物1 淡黄色针晶（氯仿）；ESI-MS m/z 375[M+H]+， 373[M-H]-； 1H-NMR （DMSO-d6， 600 MHz） δ： 12.76（1H， s， 5-OH）， 10.05（1H， s， 4′-OH）， 7.58（1H， dd， J=1.8， 8.4 Hz， H-6′）， 7.57（1H， d， J=1.8 Hz， H-2′）， 6.99（1H， s， H-8）， 6.97（1H， d， J=8.4 Hz， H-5′）， 4.02（3H， s， 7-OCH3）， 3.92（3H， s， 3-OCH3）， 3.89（3H， s， 3′-OCH3）， 3.82（3H， s， 6-OCH3）； 13C-NMR （DMSO-d6， 150 MHz） δ： 164.5（C-2）， 133.1（C-3）， 182.9（C-4）， 149.0（C-5）， 136.4 （C-6）， 152.9 （C-7）， 103.4（C-8）， 151.5（C-9）， 106.7（C-10）， 121.8（C-1′）， 110.5（C-2′）， 148.5（C-3′）， 145.7（C-4′）， 116.5（C-5′）， 120.8（C-6′）， 62.3（3-OCH3）， 61.9（7-OCH3）， 61.0（6-OCH3）， 56.3 （3′-OCH3）。上述信号归属经HSQC， HMBC波谱确证，且与文献[9]报道基本一致，故鉴定该化合物为猫眼草黄素（chrysoplenetin）。

化合物2 无色针晶（甲醇）；ESI-MS m/z 387[M+Na]+， 363[M-H]-；1H-NMR （CD3OD， 600 MHz） δ： 6.13， 5.57（各1H， s， H-17）， 4.92（1H， s， H-14）， 4.26， 4.06（各1H， dd， J=10.2， 1.2 Hz， H-20）， 3.71（1H， d， J=6.8 Hz， H-6）， 3.44（1H， dd， J=11.4， 5.8 Hz， H-1）， 1.14（3H， s， H-19）， 1.09（3H， s， H-18）； 13C-NMR （CD3OD， 150 MHz） δ： 72.6（C-1）， 29.1（C-2）， 38.4（C-3）， 33.2（C-4）， 59.7（C-5）， 73.6（C-6）， 96.9（C-7）， 61.8（C-8）， 53.8（C-9）， 41.1 （C-10）， 19.4（C-11）， 30.2（C-12）， 43.4（C-13）， 72.9（C-14）， 208.5（C-15）， 151.8（C-16）， 119.0 （C-17）， 31.8（C-18）， 20.8 （C-19）， 63.2 （C-20）。上述数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定该化合物为冬凌草甲素（oridonin）。

2.3 迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素的含量测定

2.3.1 色谱条件 Ultimate C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱，0～18 min，40%～45% A；18 min～21 min，45%～50% A；21 min～31 min，50%～55% A；31 min～32 min，55%～63% A；32 min～48 min，63%～63% A；48 min～53 min，63%～100% A。流速1.0 mL·min-1；检测波长338，242 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。在此色谱条件下，样品中迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素色谱峰的保留时间与对照品一致，3种成分的色谱峰能达到较好的分离，且纯度检查符合要求，样品其他成分对欲测成分的测定无干扰。色谱图见图1。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取迷迭香酸2.78 mg，冬凌草甲素2.84 mg，分别置10 mL量瓶中，猫眼草黄素1.42 mg，置25 mL量瓶中，分别加70%乙醇溶解并定容，摇匀。精密量取上述对照品溶液2 mL，2 mL，250 μL，置同一个5 mL量瓶中，加70%乙醇定容，摇匀，制成每1 mL分别含迷迭香酸0.111 2 mg，冬凌草甲素0.113 6 mg及猫眼草黄素0.002 84 mg的混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取冬凌草粉末（过60目筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称定重量，浸泡30 min，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液2，5，10，15，20，25 μL分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y）、进样量（μg）为横坐标（X），进行线性回归，得迷迭香酸、冬凌草甲素、猫眼草黄素的线性回归方程分别为： Y=2.577×106 X-1.916×104，0.222～2.78 μg，r=0.999 9；Y=1.365×106 X+1.263×104，0.227～2.84 μg，r=0.999 9；Y=2.948×106 X + 9.565×102，0.005 68～0.071 μg， r=0.999 7。

2.3.5 精密度试验 取同一份供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素峰面积的RSD分别为0.050%，0.049%，0.14%。表明仪器的精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取供试品溶液，分别于配制后0，1，2，4，8，12，36，48 h进样，记录峰面积，计算迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素峰面积的RSD分别为0.075%，0.53%，0.18%。表明在48 h内供试品溶液的稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 取同一批采自河南济源的冬凌草样品约1.0 g，共6份，按2.3.3项下方法制备供试品溶液。准确吸取供试液10 μL进样，测定峰面积，计算含量。结果6份样品中，迷迭香酸，冬凌草甲素，猫眼草黄素含量的RSD分别为0.80%，0.46%，0.42%，表明重复性良好。

2.3.8 加样回收率 取已知含量的采自河南济源的冬凌草样品约0.5 g，共6份，精密称定，分别加入一定量对照品，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果见表1。

2.3.9 样品含量测定 取5批冬凌草药材粉末，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进行测定，计算各供试品中迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 测定指标的选择

对冬凌草开展了比较系统的化学成分研究，分离得到7个化合物，分别为猫眼草黄素、冬凌草甲素、冬凌草乙素、牛尾草素F、胡麻素、丁二酸、4-乙酰氨基丁酸。选择迷迭香酸、冬凌草甲素、猫眼草黄素分别代表酚酸类、二萜类和黄酮类3类成分作为含量测定指标。

3.2 检测波长的选择

利用PDA检测器在200～400 nm进行紫外吸收全波长扫描，结果迷迭香酸、冬凌草甲素、猫眼草黄素的最大吸收波长分别为329，242，348 nm。在254 nm附近三者均有吸收，但许多杂质在此波长也有吸收，造成干扰。在338 nm附近，杂质干扰较小，但冬凌草甲素无吸收。因此，选择338 nm作为迷迭香酸和猫眼草黄素的检测波长，242 nm作为冬凌草甲素的检测波长。

3.3 流动相的选择

本实验先后试用了甲醇-水，甲醇-0.1%甲酸水溶液，乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸水溶液，甲醇-0.03%磷酸水溶液，从分离情况和出峰时间等综合分析，选择甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱。

3.4 提取条件的选择

比较了甲醇、50%甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇对迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素的提取效果，结果表明70%乙醇对迷迭香酸和猫眼草黄素的提取率最高。甲醇对冬凌草甲素的提取率最高，但与70%乙醇提取率相差很小，综合考虑，选择70%乙醇为提取溶剂。对提取时间进行考察，比较15，30，40 min的提取率，15 min提取不完全，30，40 min的提取率相近，从节约时间考虑，选择30 min进行提取。对溶剂用量进行考察，比较25，50，75 mL的提取率，结果表明25 mL时提取率稍差，50，75 mL时的提取率大致相同，从节约溶剂考虑，采用50 mL进行提取。考察了超声、回流2种提取方法，结果表明两种方法提取均较完全，超声提取效果略优，且操作简便。

3.5 测定结果分析

本实验以迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素为指标，对来源于河南的5批冬凌草药材中3种有效成分的含量进行了考察。从测定结果可以看出，除冬凌草甲素外，迷迭香酸和猫眼草黄素在各批药材中的含量也较高，故上述3种成分对冬凌草药材的质量控制均有重要意义。在此色谱条件下，也可检测到冬凌草乙素，但因其含量较低，未达到定量要求，故未对其进行测定。

4 结论

本实验建立了HPLC同时测定冬凌草药材中迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素含量的方法，该方法可同时测定酚酸、二萜和黄酮3类成分，较全面的反应冬凌草药材内在质量。

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Simultaneous determination of rosmarinic acid， oridonin and chrysoplenetin

in Isodon rubescens by HPLC

YUAN Xing-li1，2，3， YAN Li-hua1，2*， ZHANG Qi-wei1，2， WANG Zhi-min1，2*

（1. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2. National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Beijing 100700， China；

3. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China）

[Abstract] An HPLC method was developed for simultaneous quantitation of rosmarinic acid， oridonin and chrysoplenetin in the aerial parts of Isodon rubescens. Samples were analyzed on an Ultimate C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with methanol and water containing 0.1% formic acid as mobile phases in a linear gradient mode. The flow rate was 1.0 mL·min-1and the temperature was set at 30 ℃. The PDA detector wavelengths were set at 338 nm for rosmarinic and chrysoplenetin and at 242 nm for oridonin.The linear ranges were 0.222-2.78， 0.227-2.84 and 0.005-0.071 μg for rosmarinic acid， oridonin and chrysoplenetin， respectively. The average recoveries of the three constituents were 102.9%（RSD 1.9%）， 99.6%（RSD 1.1%） and 102.5%（RSD 0.94%），respectively. This method was proved to be accurate and repeatable， and can be used for quality control of the aerial parts of I. rubescens.

[Key words] Isodon rubescens； rosmarinic acid； oridonin； chrysoplenetin； assay； HPLC

doi：10.4268/cjcmm20131426