HPLC法测定痔炎消片绿原酸含量

【摘要】目的建立高效液相色谱法同时测定痔炎消片中绿原酸和芦丁的含量。方法采用DiamonsilC18柱（4.6mm×250mm,5μm）,流动相：乙腈-0.5%磷酸（20：80），流速：1.0ml/min,检测波长：344nm。结果绿原酸在进样量0.0192～0.48μg呈良好的线性关系；平均加样回收率为99.89%，RSD=0.33%（n=5）。芦丁在进样量为0.096～2.406μg呈良好的线性关系；平均加样回收率为99.73%，RSD=1.49%（n=5）。结论本法操作简便，重现性好，可用作该药品的质量控制。

【关键词】痔炎消片绿原酸芦丁HPLC含量测定

【Abstract】ObjectiveToestablishaHPLCmethodforthedeterminationofchlorogenicacid,rutininZhiyanxiaotablets.MethodsADiamonsilC18column（250mm×4.6mm,5μm）wasusedwithmobilephaseofacetonitrile-0.5%phosphoricacidsolution（20:80）.Theflowratewas1.0ml/minandthedetectionwavelengthwas344nm.ResultsThelinerarityrangeofchlorogenicacidandrutinwere0.0192～0.48μgand0.096～2.406μgrespectively.Theaveragerecoveryratewere99.89%（RSD=0.33%,n=5）and99.73%（RSD=1.49%,n=5）.ConclusionThismethodissimple,accurateandcanbeusedforthestandardqualitycontrolofZhiyanxiaotablets.

【Keywords】Zhiyanxiaotablet;chlorogenicacid;rutin;HPLC;determination

痔炎消片是由火麻仁、紫珠叶、槐花、金银花、地榆、白芍、三七、茅根、茵陈、枳壳十味药材经适当加工制成，具有清热解毒，润肠痛便，止血，止痛，消肿的功效，用于痔疮发炎肿痛等症［1］。在处方组成中，金银花具有清热解毒,凉散风热之功效［2］；茵陈具有清湿热，退黄疸之功效［2］；槐花具有凉血止血，清肝泻火之功效［2］。本文用同一流动相系统对金银花、茵陈中的绿原酸和槐花中的芦丁同时进行测定，结果较为满意，可用作加强本品的质量控制指标。

1仪器与试药

仪器：日本岛津LC-10Atvp泵、SPD-10Avp紫外检测仪；深圳威玛通用多媒体数据工作站；SB2200超声清洗器。绿原酸对照品（供含量测定用,批号：200212）、芦丁对照品（供含量测定用,批号：200206）,均为中国药品生物制品检定所提供。痔炎消片为广西某药业市售品（规格：0.53g/片，批号：070601，070602，070603）。乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件DiamonsilC18柱（4.6mm×250mm,5μm）,流动相：乙腈-0.5%磷酸（20：80），流速：1.0ml/min,检测波长：344nm，进样量：20μl,柱温：室温。在此色谱条件下，对照品和样品色谱图见图1～4。

2.2对照品溶液的制备

2.2.1绿原酸对照品的制备精密称取绿原酸对照品4.8mg,置20ml棕色瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置50ml棕色瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含绿原酸0.024mg）。

2.2.2芦丁对照品的制备精密称取芦丁对照品12.03mg，置20ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取10ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含芦丁0.1203mg）。

2.2.3混合对照品溶液的制备精密量取绿原酸对照品和芦顶对照品各5ml，置同一棕色瓶中，摇匀，即得。

2.3供试品溶液的制备取本品5袋内容物，混匀，研细，取0.5g，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，加甲醇-水（3：7）的溶液40ml，超声30min使溶解，放冷，加至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4空白样品的制备据处方比例，按标准制备法［1］制备不含金银花、茵陈和槐花的痔炎消颗粒，并按“2.3”项下方法同法制成阴性空白对照溶液。

2.5线性关系的考察分别精密量取对照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、25.0ml,分别置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样测定。以峰面积积分值为纵坐标，进样量（μg）为横坐标绘制标准曲线，回归方程分别为：

绿原酸：y=308248.9x+402.2,r=0.9999，线性范围为：0.0192～0.48μg;

芦丁：y=461350.8x-4078.5,r=0.9998，线性范围为：0.096～2.406μg。

2.6精密度试验对同一份供试品溶液，连续进样6次，结果绿原酸、芦丁峰面积的RSD（n=6）分别为1.81%、2.76%，表明精密度较好。

2.7稳定性试验取供试品溶液，在室温下放置0h、2h、4h、6h、8h、12h分别进样，测定峰面积，结果绿原酸、芦丁峰面积的RSD（n=6）分别为2.35%、3.37%。

2.8重复性试验取同一批次（061001）样品5份，同法测定，结果绿原酸的平均含量为2.06mg/g，RSD为0.70%；芦丁的平均含量为1.06mg/g，RSD=0.81%，表明该法重复性好。

2.9加样回收试验精密称取已知含量的样品6份，分别精密加入绿原酸、芦丁对照品适量，按“2.3”项下方法配制供试品溶液，依上述方法测定，计算回收率，结果见表1、表2。表1样品中绿原酸加样回收结果表2样品中芦丁加样回收结果

2.10样品测定取样品3个批次，根据上述色谱条件，依法进样测定含量，每批测定5份，结果见表3。

3讨论

3.1测定波长的选择经对绿原酸和芦丁的紫外吸收光谱测定，两对照品在344nm处均有较大的吸光度，因而选择344nm作为测定波长。表3样品测定结果

3.2提取方法的选择以甲醇、甲醇-水（1：1）、甲醇-水（7：3）、甲醇-水（3：7）、60%乙醇、70%乙醇6种不同溶剂分别采用超声提取和加热回流提取的实验，结果以甲醇-水（3：7）超声处理为佳。通过对超声时间10min、20min、30min、40min和60min的考察，提取时间30min与40min、60min样品中的绿原酸和芦丁无明显差别，故选用超声提取30min。

3.3流动相的选择实验中曾使用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾（40：60）［3］，乙腈-0.4%磷酸（10：90）［4］作流动相，供试品中绿原酸未能有效分离。经对乙腈-0.4%磷酸（10：90）流动相进行配比，特别是增加乙腈的浓度，选用乙腈-0.5%磷酸（20:80）作为流动相时，绿原酸、芦丁与其他成分峰的分离度好，峰形对称性良好。

实验中发现，绿原酸有光分解现象，即储存在无色容量瓶中的绿原酸对照液在实验室光照条件下放置一定时间后，色谱中除绿原酸主峰外，其后会出现一个杂质峰，其峰面积与光照时间呈正比。改用棕色瓶后，同样条件未发现此现象，因此，实验中应注意避光操作。

【参考文献】

1国家药典委员会.中华人民共和国卫生部颁药品标准（中药成方制剂第十二册），1997，172.

2国家药典委员会.中国药典（一部）.北京：化学工业出版社，2000,177;192;246.

3国家食品药品监督管理局.标准YBZ02992006（单本试行）.

4国家中成药标准汇编.中成药地方标准上升国家标准部分（外科妇科分册）.国家药品监督管理局，2002,262.