HPLC法测定氟他胺片的含量

[摘要]目的：建立用外标法测定氟他胺片含量的简单高效液相色谱方法。方法：采用PurospherStar C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相为甲醇∶水(70∶30)； 检测波长：227 nm； 进样量20 μl，流量：1.0 ml/min；温度30℃。结果：氟他胺在8.016～200.40 μg/ml浓度范围内线性关系良好（r=1）;平均回收率为98.6％，回收率的RSD为0.6％。结论：本测定方法简便快速，灵敏度高，准确度好，可用于氟他胺片的含量测定。

[关键词] 氟他胺片；含量测定；高效液相色谱法；外标法

[中图分类号] R927.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）08（c）-046-03

Determination of Flutamide tablets by HPLC

XU Chun-ming,ZHENG Guang-jun

（Jiangsu Tasly Diyi Pharmaceutical Co.,Ltd,Huaian223002,China)

[Abstract] Objective：To develop a simple method for determination of Flutamide tablets with external standard method by HPLC. Methods：The analytical column was PurospherStarC18（250 mm×4.6 mm,5 μm）.The mobile phase was methanol-water(70∶30). The detection wavelength was 227 nm.The sampler volume was 20 μl.The rate was 1.0 ml/min and the column oven was 30℃. Results：There was good linearity of Flutamide in the range of 8.016～200.40 μg/ml（r=1）； The average recovery was 98.6％ and the RSD of the recovery was 0.6%. Conclusion：The method is simple，sensitive and the result is accurate，which can be used for determination of Flutamide tablets.

[Key words] Flutamide tablets;Determination;HPLC；External standard method

氟他胺为非类固醇的雄激素拮抗剂，与雄激素竞争肿瘤部位的雄激素受体，阻滞细胞对雄激素的摄取，抑制雄激素与靶器官的结合。其化学名称为:2-二甲基-N-[4-硝基-3-（三氟甲基）苯基]丙酰胺。现在含量测定采用液相色谱法中的内标法,此方法检验和计算比较繁琐，而本文采用液相色谱法中的外标法测定氟他胺片的含量,结果准确,重现性好,样品处理简单,计算快捷。

1仪器与试药

高效液相色谱仪（Waters2695）（配备Waters2695分离单元；Waters2487双波长紫外检测器；Empower色谱工作站系统）。电子天平（Sartorius BT25S）氟他胺片样品(江苏天士力帝益药业有限公司，批号：20071128、20071129、20071130，规格：0.1 g)；氟他胺对照品(USP REFERENCE STANDAPD，批号：H1E297)；乙腈为色谱纯(上海陆都化学试剂厂，批号：20070608)。

2方法与结果

2.1色谱条件与系统实用性试验

色谱柱PurospherStarC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）(德国默克)；流动相：甲醇∶水(70∶30)；检测波长：227 nm；进样量20 μl，流量：1.0 ml/min；温度30℃，理论塔板数按氟他胺峰计应不小于2 000。

2.2方法验证

2.2.1方法专属性氟他胺原料的生产过程中，实际存在和可能存在的杂质有：杂质A(4-硝基-3-三氟甲基苯胺)、杂质B(4-硝基-3-三氟甲基乙酰苯胺)、杂质C(4-硝基-3-三氟甲基丙酰苯胺)、杂质D(3-三氟甲基苯胺)、杂质E(3-三氟甲基异丁基苯胺)和杂质F(邻-氟他胺)等，可能对氟他胺的含量测定有干扰，同时考虑氟他胺片中的辅料可能对其含量测定有影响。现设计专属性考察方法如下：取氟他胺原料加流动相制成0.40 mg/ml的溶液，作为溶液H；取各杂质对照品加流动相制成0.40 mg/ml的溶液，按杂质分别记为溶液A、B、C、D、E；另按氟他胺片的工艺处方称取各种辅料混合搅拌均匀(不加氟他胺原料)，再称取混合后的辅料0.24 g加流动相稀释至100 ml，振摇，溶解，过滤，作为溶液G；分别取溶液A、B、C、D、E、F、G、H各2 ml均加入同一个20 ml的量瓶中，加流动相适量，稀释至刻度，作为溶液a；另从溶液H中取2 ml加流动相稀释至20 ml，作为溶液b；取溶液a和b，以本文所述色谱方法分别进样，得出色谱图。从色谱图分析，在氟他胺片的含量测定中，杂质和辅料对其检测无明显的干扰。色谱峰见图1和图2。

氟他胺理论塔板数为20 568，氟他胺与杂质E的分离度为5.2，与杂质F的分离度为11。

2.2.2线性关系取氟他胺对照品减压干燥3 h后，精密称取氟他胺对照品20.04 mg置100 ml量瓶中，加流动相适量，溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准贮备液。再精密量取5 ml分别置10、25、50、100 ml量瓶中；精密量取2 ml分别置25、50 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为系列标准溶液，进样测定，结果表明本品浓度在8.016～200.40 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系，测定数据及结果见表1。回归方程为：A=5.32×104C-2.93×104(r=1)

2.2.3精密度

2.2.3.1重复性取线性关系下浓度为40.08 μg/ml的溶液，作为对照品溶液，取氟他胺片样品(江苏天士力帝益药业有限公司，批号：20071128)10片，计算出每一片的重量，研细，混匀，精密称取样品，约相当于0.32、0.40、0.48片的氟他胺的重量，各三份，加流动相溶液适量溶解并稀释至100 ml，摇匀，过滤。再精密量取上述溶液2 ml，加流动相溶液适量溶解并稀释至50 ml，摇匀，作为样品溶液。在上述色谱条件下测定其含量，9个含量数值的RSD为0.7%。含量平均值为98.4%，S值为0.007。

2.2.3.2中间精密度做重复性的当天，由其他人员以瓦里安Prostar 215为检测仪器，分析方法和样品均与重复性一致，测定9个含量数值的RSD为0.9%。含量平均值为98.0%，S值为0.009。

2.2.3.3重复性和中间精密度有无差异性评价使用F-检验的方法，评价重复性和中间精密度有无显著性差异。⑴选择显著性水平α=0.05；⑵确定S1和S2(S1S2)，S1=0.009，S2=0.007；⑶计算值，F=S12/S22=1.65；⑷计算自由度(n2-1，n2-1)=(8，8)，n1=n2=9；⑸查阅α=0.05，自由度为(8，8)，F0=3.44。判定标准：F应小于F0，重复性和中间精密度无显著性差异，本方法中F=1.65≤F0=3.44则判定重复性和中间精密度无显著性差异。

2.2.4溶液稳定试验以进样精密度试验项下的溶液作为试验样品，待进样精密度试验结束后，每隔2 h进样1次，考察8 h样品的稳定情况，以进样精密度试验的5针加上溶液稳定试验的5针共计10针，计算RSD=0.88，结果表明样品溶液室温条件下至少8 h是稳定的。

2.2.5检测方法的耐用性实验证明本方法所采用的流动相的比例、柱温度、流量、色谱柱等条件的改变，除了对氟他胺的保留时间有所改变，对其分离和检测没太大的影响。

2.2.6准确度试验

2.2.6.1对照品溶液的制备取氟他胺对照品减压干燥3 h后，精密称取氟他胺对照品20.04 mg置100 ml量瓶中，加流动相适量溶解并稀释至刻度，摇匀，作为溶液A；从溶液A中精密量取10 ml置50 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.6.2供试品溶液的制备按氟他胺片制剂处方称取辅料混合成100片的辅料量，研磨搅拌，混合均匀，精密称取混合的辅料约0.24 g，分别置9个100 ml的量瓶中；再精密称取氟他胺原料约16.0、20.0、24.0 mg各三份，分别置上述9个放辅料的量瓶中，混合均匀后，加流动相适量溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，从中精密量取10 ml置50 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。以上述色谱条件进样测定，测定回收率，其结果见表2。

2.3样品含量测定

2.3.1溶液的制备取氟他胺10片，精密称定，研细，精密称取样品适量（约相当于氟他胺0.1 g），加流动相溶液适量溶解并稀释至100 ml，摇匀，过滤。再精密量取上述溶液2 ml，加流动相溶液适量溶解并稀释至50 ml，作为供试品溶液。

2.3.2氟他胺对照品溶液的制备取经减压干燥3 h的氟他胺对照品约20 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，加流动相溶液适量溶解并稀释至刻度，摇匀。精密取上述对照品溶液10 ml置50 ml量瓶中，加流动相溶液适量溶解并稀释至刻度，摇匀，做为对照品溶液。

2.3.3含量测定色谱柱purospherStarC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）(德国默克)；流动相：甲醇∶水(70∶30)；检测波长：227 nm； 进样量20 μl，流量：1.0 ml/min；柱温30℃。按“高效液相测定法”以外标法以峰面积计算测定其含量。

2.3.4供试品HPLC法的内标法同外标法测定结果比较

2.3.4.1内标法测定氟他胺片的含量（1）色谱条件与系统实用性试验：色谱柱PurospherStarC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）(德国默克)；流动相：甲醇∶水(60∶40)；检测波长：230 nm；进样量10 μl，流量：1.0 ml/min；温度30℃，理论塔板数按氟他胺峰计应不小于2 000。（2）内标溶液的制备：称取醋酸氢化可的松，加甲醇制成每1 ml中含0.23 mg的溶液即得。（3）含量测定：取氟他胺对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量制成每1 ml中约含0.20 mg的溶液，精密量取该溶液与内标溶液各5 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取10 μl注入液相色谱仪，操作，记录色谱图；另取样品适量，在研钵中研成细粉混合均匀，精密称取细粉适量（约相当于氟他胺0.1 g）置100 ml量瓶中加甲醇适量溶解并稀释置刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 ml于50 ml量瓶中，精密加人内标溶液5 ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，取10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按内标法以峰面积计算。（4）计算：按下式计算标示量式中f：校正因子；As：内标物的峰面积；Ar：对照品的峰面积；Ax：供试品的峰面积；Cs：内标物的浓度；Cr：对照品的浓度；Cx：供试品的浓度；Wo：供试品的平均片重；0.25：氟他胺片的规格（0.25 g）。

2.3.4.2外标法测定氟他胺片的含量测定方法即本文所述的检测方法和检测条件。3个批号的供试品用内标法同外标法测定结果见表2。两方法测定结果偏差较小。

3讨论

3.1检测波长的选择

氟他胺在227 nm及295 nm的波长处均有最大吸收，均可作为液相色谱分析的检测波长，而本文采用227 nm作为检测波长，是以内标法测定氟他胺含量中所用的检测波长230 nm作为参考，选择了和它比较接近的227 nm作为氟他胺的检测波长。

3.2溶液的稳定性

从本文的检测数据来看，样品溶液在8 h内都是稳定的，对于放置了更长的时间，样品是否稳定，本文没做进一步的考察。对于样品检测过程中，需注意溶剂挥发所引起的检测误差的问题，由于氟他胺采用流动相做溶剂，流动相中甲醇占70%很容易挥发，如果样品密封不好的话很容易造成样品测量的峰面积偏高。故本文建议样品与对照品均不易放置太长的时间，最好在3～4 h以内。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学工业出版社，2005.

[2]于世林.高效液相色谱方法及应用[M].北京：化学工业出版社，

2005.

[3]国家药品监督管理局.国家药品监督管理局标准（试行）[S].WS-152(X-142)-99.

（收稿日期：2008-03-18）

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