RP—HPLC测定桑叶中绿原酸的含量

[摘要] 目的 建立反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定桑叶中活性成分绿原酸的方法。 方法 采用Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 ？滋m）色谱柱；流动相为乙腈-1.0%醋酸水溶液，采用梯度洗脱，检测波长为325 nm，流速1.0 ml/min，柱温30℃，进样体积10 μl。 结果 绿原酸的线性范围为0.3890～7.771 ？滋g（r=0.9994），平均回收率为98.91%。 结论 RP-HPLC检测效率高，专属性强，重复性好，可用于桑叶中绿原酸的定量测定，可作为该药材的质量控制方法之一。

[关键词] 桑叶；绿原酸；质量控制；反相高效液相色谱法

[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0017-03

桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶，初露后采收，除去杂质，晒干，具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目之功效。主要用于风热感冒，肺热燥咳，头昏头痛，目赤昏花[1]。现代药理研究表明桑叶具有降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等功效[2-4]。对桑叶的质量控制研究大部分围绕中桑叶中的活性成分芦丁来进行相应的含量测定[5-6]，也有的围绕黄酮类成分进行相应质量控制研究[7]。目前，国内外市场对桑叶的需求愈来愈大，且本课题组在前期指纹图谱研究中发现绿原酸也是桑叶中的主要活性成分之一[8]，因此为了进一步控制桑叶质量，本研究采用反相高效液相色谱法（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）对从全国收集的桑叶药材进行绿原酸含量测定研究，现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；BPZ11D型电子分析天平（Sartorius公司）；Waters2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器（Waters 公司）。

1.2 试剂

甲醇（色谱纯，TEDIA公司），乙腈（色谱纯，TEDIA公司），水为哇哈哈纯净水，冰乙酸（色谱纯，北京化工厂）。

1.3 对照品及样品

对照品绿原酸购于中国药品生物制品检定所（供含量测定用，批号110753-200413），不同产地的桑叶药材，均由湖南中医药大学生药学教研室潘清平教授鉴定为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 ？滋m）；流速：1.0 ml/min；检测波长：325 nm；柱温：30℃；进样体积：10 μl；流动相：乙腈（A）-1.0%醋酸水（B）梯度洗脱，洗脱程序：020 min，9%A18%A。按照上述色谱条件，待测成分绿原酸分离很好，无干扰，得色谱图1。

2.2 供试品制备

取桑叶粉（80目）约1 g置50 ml三角瓶，精密称定，加甲醇20 ml，称重，超声30 min（功率250 W，频率40 kHz），取出，静置，放凉，补重，0.22 μm微孔滤膜滤过，RP-HPLC分析。

2.3 对照品制备

精密称取绿原酸对照品适量，用甲醇溶解，定容，得到浓度为0.3890 ？滋g/？滋l的对照品溶液。

2.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取“2.3”项下的绿原酸对照品溶液1、3、5、8、10、15、20 ？滋l进样分析，记录按上述色谱条件测定的峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），进样体积（？滋l）为横坐标（X），得绿原酸的线性回归方程分别为：Y=182 283X-131 274（r=0.9994，0.3890～7.771 ？滋g）。

2.5 精密度

取同一供试品溶液，按上述RP-HPLC分析条件，连续进样6次，计算绿原酸峰面积，结果表明，峰面积RSD值

2.6 重现性

一份固定粉末样品，平行制备6份供试品溶液，进行RP-HPLC分析，考察绿原酸峰面积，峰面积的RSD值

2.7 稳定性

制备药材供试品溶液后，在室温下放置不同时间，分别于0、1、2、4、8、12、24、48 h进行RP-HPLC分析，以绿原酸的峰面积计算，考察样品的稳定性，主要成分的峰面积在48 h内RSD值

2.8 回收率试验

取同一批已知含量的桑叶药材样品约0.5 g，精密称定，分别精密加入一定量绿原酸对照品溶液，按“2.2”项制成加样供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，计算回收率（表1）。从表1中可知，样品的平均回收率为98.91%，RSD为0.84%，表明回收率符合要求。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.9 含量测定

按照上述色谱条件，将不同产地的样品进行处理和进样，每一个相同产地及批号的样品测3份，采用外标两点法计算桑叶中绿原酸的平均含量（表2）。从表2中可知，不同产地的桑叶药材绿原酸含量均在0.25%以上，最高的可达0.90%，提示绿原酸确实为桑叶中的一个主要成分。

表2 桑叶药材来源及其绿原酸含量的测定结果（n=3）

3 讨论

本实验根据定量化合物为酚酸，在甲醇中有较好的溶解度，选择甲醇超声，处理容易、可控；且样品呈酸性，选择醋酸水溶液作为水相，水相中醋酸比例是通过单因素多水平试验确定最佳比例为1.0%。选择乙腈作为有机相来分析中药复方，柱压稳定且较低，有利于保护仪器和色谱柱。波长选择325 nm也是基于所测化合物在该波长处吸收最大，且杂质干扰较少。梯度选择均一梯度变化以保证样品具有更好的重复性。

含量测定结果表明，不同产地桑叶活性成分绿原酸含量相差较大，中部地区河南、湖南产地的桑叶绿原酸含量较高。与目前药典中收载的芦丁含量相比，桑叶中绿原酸的含量均大于芦丁，因此建议药典桑叶标准中增加绿原酸含量测定。

在此次含量测定中，发现桑叶样品还有其他几个明显的色谱峰，课题组下一步准备分离制备这些色谱峰，进行相应结构鉴定和富集，为下一步开展桑叶中主要成分含量测定及其活性测试奠定基础。

中药质量标准是一个系统工程[9]，本文仅对桑叶中绿原酸的含量进行了测定，只是其质量标准的一个部分。其中，影响桑叶中绿原酸含量的因素很多，如产地、初加工、采收季节等，因此，只能把绿原酸作为评价桑叶质量的指标之一，应该建立更为系统、全面、体现中药特点的桑叶质量标准。

[参考文献]

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[3] 陈建国，步文磊.桑叶多糖降糖作用及其机制研究[J].中草药，2011，42（3）：515-520.

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[5] 雷霖，何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].中国卫生检验杂志，2012，22（3）：468-469.

[6] 周美环，赵书楷，陈淼，等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（5）：228-229.

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（收稿日期：2013-12-03 本文编辑：郭静娟）