HPLC法测定大黄素含量

【摘要】目的建立用高效液相色谱（HPLC）法测定复方奥硝唑大黄口腔膜中大黄素的含量。方法采用HPLC法,色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18（4.6mm×150mm,5μm）,流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液（4：1）,流速为1.0ml/min,柱温为30℃,检测波长为254nm。结果大黄素在0.04～0.4μg/ml（r=0.9998）范围内线性关系良好。大黄素平均回收率分别为98.25%。结论该方法操作简便、快速、准确。

【关键词】复方奥硝唑大黄口腔膜；大黄素；高效液相色谱法

【Abstract】ObjectiveToestablishamethodforthedeterminationofemodinincompoundornidazole-rhubarbbuccalfilmbyHPLC.MethodsAHPLCmethodwasusedwithAgilentZORBAXSB-C18column（150mm×4.6mm,5μm）.Themobilephasewasmethanol-0.1%phosphoricacid（4:1）.Theflowratewas1.0mL/min.Thecolumntemperaturewas40℃andthedetectionwavelengthwas254nm.ResultsThecalibrationcurvewaslinearintherangeof0.04～0.4μg（r=0.9998）.Theaveragerecoverywas98.25%.ConclusionThemethodissimple,rapidandaccurate.

【Keywords】compoundornidazole-rhubarbbuccalfilm；emodin；HPLC

牙周炎是一种常见病、多发病，由厌氧菌感染引起，局部应用抗菌药物对于牙周病的治疗有很好的效果。以往报道的牙周炎药膜多以生物不降解的材料为辅料，使用中需要定时更换。复方奥硝唑大黄口腔膜由兰州大学药学院和兰州市第一人民医院口腔科合作开发作为医师协定处方，治疗牙周炎，疗效确切。它以奥硝唑为主药，大黄提取物中蒽醌类成分为辅药，具有活血化淤、消炎止痛、促进创面愈合等作用。该口腔膜剂是生物可吸收性牙周炎药膜，应用时不需要更换药膜，可被机体有效吸收，达到长效和加强愈合的作用［1，2］。为有效地控制该口腔膜剂的内在质量，确保临床疗效，本文报道采用反相高效液相色谱法测定大黄素含量。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent-1100高效液相色谱仪,G1315A/BDAD检测器,G1313ALS自动进样器,Agilent-1100色谱工作站（美国安捷伦科技有限公司）；BS224型电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ5200DB型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；0.45μm滤膜（天津Do-Chrom科技有限公司）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂，型号TDL-40B）；SZ-97自动三重纯水蒸馏器（上海科析亚荣生化仪器厂）；DZKW-4水浴锅（上海实验仪器厂）。

1.2试剂甲醇（色谱纯）、磷酸（分析纯）、水（重蒸馏纯净水）、大黄素对照品（中国药品生物制品检定所,批号：0854-200532）。

复方奥硝唑大黄口腔膜的制备［3］：按2：1称取PVA17-88和CMC-Na，分别加适量蒸馏水浸泡12h，使其充分溶胀。再将PVA和CMC-Na分别置85℃～95℃水浴上加热溶解后混合，过滤备用。按处方量称取奥硝唑溶于热蒸馏水中，称取大黄提取物溶于90%乙醇中，并将它们加入备用的成膜材料浆液中，加入甜蜜素、甘油，适量水至规定量，搅拌均匀后，于超声仪中超声30min脱泡后，倾入预先涂有少量液体石蜡的玻璃板上，于净化室内铺膜，避光，50℃～60℃干燥，启膜，在紫外灯下照射15min灭菌，在净化台上分割成1cm×0.5cm药膜（每片含大黄提取物约50mg，奥硝唑约1mg），密封包装（烫封于聚乙烯薄膜中）。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱AgilentZORBAXSB-C18（4.6mm×150mm,5μm）,流动相:甲醇-0.1%磷酸水溶液（4：1）；流速:1.0ml/min；柱温:30℃；检测波长:254nm，进样量10μl。

2.2试验溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品各5mg分别于两个50ml量瓶中,加甲醇溶解制成0.1mg/ml大黄素储备液,各取上述溶液2ml于10ml量瓶中,加甲醇定容,即得含大黄素（20mg/L）对照品溶液。

2.2.2样品溶液的制备取复方奥硝唑大黄口腔膜10cm2（含大黄酚9.49mg），剪碎，置50ml容量瓶，加甲醇定容至刻度，超声30min使膜完全溶解，取上清液10ml于离心管中，以4000r/min离心10min，取上清液5ml，置烧瓶中,挥去甲醇,加2.5mol/L的硫酸溶液10ml,超声5min,加氯仿10ml,置水浴中加热回流水解1h,冷却,转移至分液漏斗中,烧瓶用少量氯仿润洗3次,用氯仿振摇萃取3次,每次10ml,合并氯仿液,用无水硫酸钠脱水,减压蒸馏挥去氯仿,残渣用甲醇溶解,移至10ml量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜（0.45μm）滤过,取续滤液,即得。

2.2.3阴性样品溶液的制备除大黄外,按“仪器与试药”制备复方奥硝唑大黄口腔膜阴性样品，再按样品溶液的制备制成阴性溶液。

2.2.4大黄对照药材溶液取大黄对照药材按样品溶液制备方法制备,即得。

2.3系统适应性试验取样品溶液、阴性样品溶液、大黄对照药材溶液和大黄素对照品溶液,在上述色谱条件下进样10μl,结果阴性样品对大黄素测定无干扰。见图1。

2.4线性关系精密吸取含大黄素对照品溶液2、4、8、10、14、16、20μl按上述色谱条件依次进样,以对照品进样量X（μg）为横坐标,峰面积Y为纵坐标作标准曲线,得回归方程:Y=3140.50X-6.10,r=0.9998。结果表明,大黄素进样量在0.04～0.4μg范围内具有良好的线性关系。

2.5精密度试验取同一浓度对照品溶液,在相同色谱条件下重复进样5次,结果大黄素峰面积的RSD为0.42%（n=5）。

2.6稳定性试验取同一样品溶液,分别于0、2、4、6、8、10、12h时进样,测定峰面积,结果大黄素的RSD为1.20%（n=7）,表明样品溶液在12h内稳定性良好。

2.7重复性试验取同一批号（071103）复方奥硝唑大黄口腔膜样品,按样品含量测定方法测定,结果测得大黄素含量为0.9495mg/cm,RSD为1.25%（n=6）。

2.8加样回收试验精密称取已知含量的复方奥硝唑大黄口腔膜（大黄素0.9495mg/cm）5份，分别精密加入大黄素储备液1ml,同“2.2.2”处理,测定峰面积,计算回收率。见表1。表1大黄素回收率试验结果

2.9样品测定取2批复方奥硝唑大黄口腔膜,分别按2.2.2项下处理后,进样10μl,测定峰面积，计算大黄素含量。见表2。表2样品含量测定

3讨论

在选择检测波长时,取大黄素对照品溶液在200～360nm波长范围内扫描,结果在254nm波长处有最大吸收,且样品中其他成分在此波长处对测定无干扰,灵敏度高,可准确测定大黄素,故测定波长选定254nm。

选择样品处理方法时,参考文献资料［4，5］,比较了几种处理方法,实验证明,本文用的样品处理方法,其分离度好,无干扰,峰信号较强。

采用HPLC法测定复方奥硝唑大黄口腔膜中大黄素含量,该法分离度好,灵敏度高,稳定性好,可作为其质量控制方法。

【参考文献】

1李淑娟，董晓华，武海霞，等.大黄及其有效成分药理作用研究进展.医学综述，2005，11（1）:76.

2MunozE,CastellaJ,GutierrezJF.InvivoandinvitrosensitivityofTrichomonasgallinaetosomenitroimidazoledrugs.VetParasitol,1998,78（4）:239.

3安媛，孙德江.奥硝唑口腔膜剂的制备及质量控制.中国药房，2005，16（12）：908-909.

4国家药典委员会.中国药典一部.北京：化学工业出版社，2005，354-355.

5刘腊娥,陈立新,杨长成,等.HPLC测定洁康舒洗剂中大黄酸、大黄素及黄酚的含量.中成药,2004,26（9）：710-713.