不同强度动训练对大鼠心室肌胶原纤维和Cx43、Cx45影响的实验研究

摘 要: 目的:探讨有氧训练和无氧训练对大鼠心室肌胶原纤维形态结构和Cx43、Cx45分布和 表达的影响。方法:采用跑台训练方式,建立大鼠有氧运动和疲劳运动模型,采用Masson染 色法和免疫组织化学SABC法观察心室肌胶原纤维形态结构和Cx43、Cx45表达的变化。结果: 有氧训练组心室肌胶原纤维分布均匀,结构完整,Cx43、Cx45构型端端连接多于侧侧连 接且表达均显著高于安静对照组和疲劳训练组(P

关键词:运动训练;免疫组化;心室肌;连接蛋白

中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编号 :1007-3612(2009)06-0047-04

Effects of Exercise for Collagen Fibers and the expression of Cx 43, Cx45 on Rat's Ventricular myocardium

WANG Youhua,TIAN Zhenjun

(Institute of Physical Education, Shaanxi Normal University,Xi 'an 710062, Shaanxi China)

Abstract: Objective To investigate the effects of aerobic training and training induced fatigue for collagen fibers and Cx43, Cx45 of ventricular myocardium. Me thods Rat models of aerobic training and traininginduced fatigue groups were e s tablished through running on an animal treadmill. Masson staining and immunohist ochemistry SABC were applied to observation collagen fiber tissue structure, dis tribution and the expression of Cx43, Cx45 in the ventricular myocardium. Result s In the aerobic training group, collagen fibers uniform arrangement and structu re integrity, distribution of Cx43, Cx45 that endtoend fashion more than sid e toside orientation and the expression of Cx43, Cx45 in aerobic training groupwas higher than that in the control group and traininginduced fatigue group si gnificantly (P

Key words: Exercise training; Immunohistochemistry; Ventricular myocardi um; Gap junction protein

心脏间质成分在心脏中起着不可忽视的作用,资料显示,心肌细胞间质成分不仅对心肌细 胞具有支持和联接作用,而且在协调心肌力的传递,信息的转导,营养物质的输送等方面都 起着重要的作用。连接蛋白(Connexins,Cxs)组成心脏的间隙连接,为心脏细胞间通讯提供 代谢偶联和电偶联,并为心肌的同步收缩提供低电阻传导途径。同时该连接构成相邻细胞间 亲水管道,对于细胞间信息传导,细胞的生长、分化及维持心肌节律性同步收缩有重要意义 。资料显示,连接蛋白的有序化分布是维持和保证心脏收缩和舒张的基本解剖学基础。心脏 胶原纤维和Cxs协调作用,保证心脏正常的物质、信息交流和脉冲传导。然而,不同运动强 度对心室肌胶原纤维与Cxs的分布和量,尤其是对胶原纤维和Cxs二者的联合影响,文献报道 少见。本研究观察了不同强度运动训练对对大鼠心室肌胶原纤维、Cxs阳性表达的形态学变 化,为进一步揭示运动实践中心律失常和运动猝死的生物学机制提供文献资料和理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料雄性SD大鼠(购于陕西中医研究所)45只,3月龄,体重(252±13)g,国家标准啮齿类动物 干燥饲料喂养,自由饮食,温度18～23℃,湿度40%～60%。随机分为3组:安静对照组, 有氧训练组和疲劳训练组。

1.2 实验方法

1.2.1 运动模型的建立适应训练:动物适应喂养1 周后开始训练,采用递增强度的方式 进行跑台运动,起始速度为20 m/min,时间为20 min。运动负荷参考Bedford(1979)训练 模型略加改动。安静对照组:正常笼内生活状态,不运动。有氧训练组:训练5 d/周,速度 为20 m/min,运动时间每隔两天递增一次、运动速度不变,运动时间每隔两天增加5 min, 当时间增加至60 min/d后增加跑台坡度为5%,以后时间不再增加,直至训练结束。疲劳训 练组:训练6 d/周,起始速度为20 m/min,运动速度和时间每天递增,递增速度3 m/min 、时间5 min,运动至速度为35 m/min,训练速度不变,训练时间每天递增,当训练时间增 加到(60±10)min/d后,增加跑台坡度为10%。训练过程用电刺激来强迫大鼠进行跑台训练 (电刺激

1.2.2 大鼠Masson染色和免疫组化标本制备运动训练8周后次日,每组取8只大鼠,称重后用乌拉坦麻醉,开胸行左 心室穿刺灌注,同时 剪破右心耳放血。灌注过程中,先用加3‰肝素的生理盐水灌注15 min左右,直至流出液体 为粉红色时换用中性甲醛固定液灌注40 min左右。将灌注好的标本置于预先准备的冰盘上并 迅速取材,中性甲醛固定48 h,全自动组织脱水机进行脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,全自 动组织包埋机包埋。

1.2.3 运动大鼠心室肌的Masson染色、免疫组织化学染色和观察采用常规Masson染色。免疫组织化学染色采用SABC法。SABC试剂盒,DAB显色试剂盒,兔抗 小鼠、大鼠、人多克隆抗体cx43、cx45均购自武汉博士德生物工程有限公司。切片用去离子 水冲洗,3%H2O2封闭8 min,去离子水冲洗,抗原高压修复,PBS冲洗,加生物素封闭液 A 10 min,PBS冲洗,加生物素封闭液B 10 min,PBS冲洗,滴加正常山羊血清20 min,滴加 一抗Cx43、Cx45(1:75),4 ℃过夜,37 ℃复温,PBS冲洗;滴加二抗37 ℃ 20 min,PBS冲 洗,滴加SABC 20 min,Tween+PBS混合液冲洗2 h,DAB显色,蒸馏水冲洗。两套切片,一套 苏木精复染,分化,另一套不复染,脱水,透明,中性树胶封片。复染的用于组织阳性表达 形态学观察,未复染的用于光密度测定。每次染色设阴性对照染色,PBS取代一抗,其它程 序相同。Leika光学显微镜观察、拍照。

1.2.4 免疫组化图像分析光密度值测定采用Image pro plus 5.1软件包进行,对免疫组化染色阳性反应产物进行定量 分析,低倍下选准位置后,400倍下拍照扫描,阳性产物强度应用图像分析系统平均光密度 值表示,其原理为阳性产物吸收光的多少,计算为透射光强度/入射光强度的负对数,值越 大,阳性产物越多,反之越小。

1.2.5 数据处理 所有数据运用SPSS12.0 for Windows软件包进 行处理。统计学方法采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。实验结果以均数±标准差( X±SD)表示平均光密度值(OD)。显著性差异选择P

2 研究结果

2.1 各组大鼠心室肌胶原纤维的变化Masson染色主要区分胶原纤维和肌纤维,染色结果胶原纤维呈蓝色,细胞质、心肌纤维和红 细胞呈红色,胞核呈蓝褐色。实验研究发现,安静对照组和有氧训练组心室肌胶原纤维分布 均匀,对心室肌实质细胞起较好的连接、支持和保护作用。疲劳训练组心室肌胶原纤维分布 紊乱,有过度增生和区域化溶解现象,部分区域胶原纤维穿插入肌纤维中,形成心室肌纤维 化。另有区域显示变性坏死现象(图1)。

图1 不同运动训练对心室肌胶原纤维的影响,×4002.2 各组大鼠心室肌Cx43、Cx45的变化光镜下,Cxs在各组大鼠心室肌均有表达。Cx43和Cx45平均光密度值均为有氧训练组>安静对 照组>疲劳训练组。Cx43、Cx45构型安静对照组、有氧训练组和疲劳训练组存在显著差异, 安静对照组和有氧训练组Cx43、Cx45在心室肌分布较规律,端-端连接多于侧-侧连接。疲 劳训练组大鼠心室肌Cxs分布较紊乱,有区域化溶解和消失,并发现有Cxs汇聚于细胞侧面、 聚集成块等现象。各组间Cx43光密度值有氧训练组显著高于安静对照组和疲劳训练组(P

表1 运动训练大鼠心室肌细胞Cx43和Cx45表达的平均光密度值变化

组别nCx43 OD value变化率/%Cx45 OD value变化率/%安静对照组80.4 854±0.0 417-0.2 839±0.0 412/有氧训练组80.6 417±0.0 139*32.20020.3 411±0.0 256*20.1 479疲劳训练组80.3 854±0.0 268#-20.6 0160.2 359±0.0 369#-16.9 074*P

本实验室的前期研究证实,不同运动训练对大鼠心肌组织结构影响较大,有氧运动使大鼠心 肌向良性发展,使心肌实质成分和间质成分成比例增长且超微结构完整;而大强度运动使心 肌组织结构发生病理改变,心肌胶原纤维过渡增多且超微结构紊乱[1,2]。本实验 采用Mass on染色方法证实了不同运动对心室肌胶原纤维显微结构存在不同影响,疲劳训练组心肌纤维 化;同时,Cx43、Cx45分布模式和表达均发生不同程度变化。本实验首次系统研究不同运动 造成心室肌胶原纤维和Cxs及二者相结合的变化规律。

众多研究表明,不同运动强度造成胶原含量和性能的不同变化,然而,心肌纤维化状态下连 接蛋白的变化规律少见报道。本研究发现,疲劳训练组胶原纤维排列紊乱,胶原纤维过度增 生且有区域化溶解现象。同时连接蛋白构型和表达发生病理改变。早期研究表明,运动训练 增加心肌的4-羟脯氨酸合酶,该酶与胶原合成呈正相关[3]。另有研究表明,自发 性高血压 大鼠模型心肌顺应性改变与心肌胶原交联程度相关,而与心肌胶原总量和比例失调呈负相关 [4]。疲劳训练组胶原异常增生且分布紊乱,将改变心肌收缩和舒张的整体顺应性 。同时, 心脏缝隙连接通道结构和功能异常所致的细胞间电偶联障碍是心率失常的重要原因。心室肌 Cxs变化与心室肌脉冲传导速度、心室肌整体传导不齐关系密切,是室性心率失常的基本解 剖学基础。Cx43、Cx45是组成心脏缝隙联结的主要蛋白,国内外对其研究较多,李玉光等报 道,急性心肌缺血时,Cx43迅速降解。端-端连接比侧-侧连接处降解明显,中间层心肌比 心内膜下心肌和心外膜下心肌降解更明显。端-端处Cx43明显减少会导致心脏纵向传导速度 严重下降,传导的各向异性发生明显改变,这些改变是导致传导阻滞和折返传导,是诱发心 率失常发生的原因[5]。闫纯英等研究发现,急性心肌缺血时Cx43迅速降解,心肌 电传导速 度明显下降;缺血区各局部传导速度与该部位Cx43表达水平呈显著正相关;出现持久传导阻 滞的区域其Cx43降解程度均大于50%。急性短时间(1 h)缺血时Cx43的降解已经开始对心肌传 导速度产生明显的影响作用,而局部心肌Cx43的严重降解将导致该区域出现持久性传导阻滞 [6]。闫纯英等还证实了压力超负荷所致的左室肥大心肌间隙连接分布模式的改变 和脉冲在 心室肌传导的各向异性增大,这种改变可能是心肌肥大时常伴发心率失常的重要原因之一[7 ]。另有研究报道,心脏在病理情况下,Cxs先是代偿性增加以适应心肌收缩和舒张的需 要, 此种情况下Cxs的消耗是正常情况下的数倍,Cxs的代偿是有限的,随着病理情况的加重,Cx s失代偿,正常有规律的构型被打破,导致闰盘结构消失[8]。常芸等研究发现,一 次力竭运 动和反复力竭运动均可造成心肌Cx43的降解以及分布模式的改变[9]。本研究发现 ,疲劳训 练组Cx43、Cx45不但构型发生显著性改变,平均光密度值也发生了显著性改变,Cx43、Cx45 区域化减少或汇聚于细胞侧面,推测此将使Cxs兴奋传导受到阻碍并使形成折返传导的机率 加大。因为Cxs正常构型是心脏传导的解剖学基础。有研究报道,病理情况下,随着心衰程 度的加大,Cxs先是发生构型改变,端-端连接减少,侧-侧连接增加,心肌脉冲的传导减 慢并形成折返传导的机率加大,随着心衰程度的加重,Cxs发生降解,Cxs量减少,使传导阻 滞加重,进而诱发心率失常[10-12]。本研究发现,疲劳训练组运动使侧-侧电偶 联增多 ,端-端电偶联减少,且分布紊乱。资料显示,心脏脉冲的传导存在各向异性。各向异性低 时,正常有序化的心脏收缩和舒张将被打破,发生折返性的机率增大,较易发生心房颤动和 心率失常,在心室,脉冲的纵向传导速度约为横向的3倍[13]。疲劳训练组的构型 变化增加 了横向传导,减低了各向异性传导的能力,使传导速度减慢,增加了折返环形成的机会,诱 使心率失常的发生。怎样以Cxs为靶点,补充能量或药物干预减少Cxs的构型改变,增加Cxs 的表达,此方面的进一步研究对预防和治疗运动性心率失常将有促进作用。

新近研究发现,心脏缝隙连接电偶联减少50%对心脏脉冲传导和心律失常没有影响。电偶联 降低到非常低的水平才能导致传导消弱和心律失常,表明心肌脉冲有一个很大的传导储备, 其能保护正常的脉冲传导甚至在电偶联适度的降低情况下。然而,心肌胶原水平增加发生心 肌纤维化与连接蛋白减少相结合,将导致反常的兴奋传导并提高心律失常的发生[14]。本研 究发现,疲劳训练组心肌纤维化的同时,Cxs构型改变且表达降低,表明疲劳训练组心肌纤 维化和连接蛋白构型改变及量的减少联合作用,将是导致运动性心律失常和运动猝死的重要 原因。我们前期的研究发现,大强度疲劳训练可造成大鼠心脏房室结组织结构发生纤维化, Cx43和Cx45均构型改变且表达显著降低[15]。本研究与上述研究结论一致,表明心 肌重塑与 Cxs变化是互相依赖、互相影响的,心肌在重塑过程中,心肌细胞肥大、细胞丧失、细胞 外基质增加都会导致Cxs在心肌细胞表面有序极化分布和心脏空间规律性分布的紊乱。连接 蛋白紊乱引起的缝隙连接丧失导致代谢偶联的中断,进一步引起心肌重塑。疲劳训练导致的 心肌重塑缝隙连接电重构的联合作用应是运动性心律失常和运动猝死的主要原因。早期流行 病学调查(Drory, 1991) 250例年轻人运动猝死的病例中发现,心源性疾病占82%。在13～35 岁年龄组,最常见的猝死原因是肥厚性心肌病。表明心肌重塑导致的病理性肥大与缝隙连接 重构均为心律失常和猝死的关键因素。心肌胶原纤维主要有I型和Ⅲ型,运动造成哪种类型 胶原改变对Cxs构型改变起主要作用,有待于进一步深入研究。同时,引起心肌重塑的原因 还包括心肌缺血、血流动力学超负荷、炎症因子等都可导致Cxs的变化。Cx43介导GJ的通透 性还受到Cx43蛋白的磷酸化、去磷酸化、分布、表达和降解的影响。缺血导致Ca2+的 升高、 酸中毒、ATP的耗竭和脂类等代谢产物均可降低甚至中断细胞间电藕联。大强度疲劳训练是 一过性缺血缺氧过程,引起的Ca2+升高,乳酸堆积引起的酸中毒,ATP消耗殆尽,脂 类等代 谢产物的降低可能是使Cxs分布模式发生变化和表达减少的原因。新近研究发现,连接蛋白 构型改变和减少引起心律失常的分子机制与Cxs整合的M3受体分离关系密切。研究报道,心 肌缺血再灌可破坏心肌M3受体和Cx43之间的整合[16]。因为M3受体耦联一种新型的 延迟整流钾电流(IKM3),M3受体的变化将改变细胞膜K+通道,进一步影响Ca2+通道 ,改变细胞动作电位。通过实验证实M3受体激动剂乙酰胆碱可以抑制4-DAMP(脱氧腺苷酸) 所诱导的心律失常,M3-R/IKM3将成为抗心律失常药物的新靶点[17]。大强度运动 后的血液恢复供应类似于缺 血再灌注损伤,大强度运动后M3受体与心律失常的关系应受到重视,心肌M3受体是心律失常 药物作用的新靶点,这也可能是Cxs构型改变和减少后引起心律失常的分子机制。另有研究 报道,间质钙粘附素、上皮型钙粘附素对维持Cxs稳定有重要作用,在敲除N-Cadherin鼠的 心脏中发现Cx43、Cx40显著减少[18]。大强度疲劳运动将诱使钙粘附素如何变化, 与Cxs分布模式和减少有何关系,有待进一步研究证实。

4 小 结

不同运动强度运动训练可使大鼠心室肌胶原纤维和Cxs发生不同程度的改变,有氧运动使大 鼠心室肌胶原纤维良性分布,Cxs增多且构型正常,起到良好的信息流通和脉冲传导作用, 有利于心室肌收缩和舒张的整体一致性。大强度训练使大鼠心室肌胶原纤维发生病理改变, Cxs发生构型改变且表达显著减少,并有区域化溶解和汇聚现象,表明心脏正常有序的电传 导被打破。推测疲劳训练组心室肌胶原纤维和Cxs的改变尤其是二者的联合作用与运动实践 中运动性心律失常和运动猝死关系密切。

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