脐血血浆对T淋巴细胞增殖\分化的影响续一连

【摘要】目的 探讨混合脐血血浆(cord blood plasmaCBP)在植物血凝集素（phytohemagglutin,PHA）诱导脐血源性T淋巴细胞增殖中的作用。方法 收集脐血血浆和脐血单个核细胞；将脐血单个核细胞分为CBP+PHA和PHA两组，检测两组细胞增殖率及免疫表型。结果 CBP+PHA组细胞增殖指数低于PHA组，但无统计学意义（P>0.05）；两组细胞表型都以CD3+、CD4+为主，两组差异无统计学意义（P>0.05）。结论 混合脐血血浆对脐血源性T淋巴细胞增殖、分化影响不明显，可能与RPMI1640培养体系具有相似的效果。

【关键词】脐血 T淋巴细胞 增殖 分化

中图分类号：R392文献标识码：A文章编号：1005-0515（2011）11-021-02

Effects of mixed cord blood plasma on cord blood-derived T lymphocyte proliferation and differentiation

XU Yi-lian

（Jining Blood Center, Jining 272041,China）

【Abstract】Objective To study on the effects of mixed cord blood plasma（CBP） on PHA induction of cord blood-derived T cells. Methods collected cord blood plasma and umbilical cord blood mononuclear cells(CBMCs); CBMCs were divided two groups:CBP+PHA group and PHA group, measured the proliferation index and immune phenotypes of esch group.Results The results showed that the proliferation index of CBP+PHA group was lower than that PHA group,but there had no statistical significance (p>0.05);the immune phenotypes of two groups were both mainly CD3+and CD4+,differences had no statistical significance (p>0.05).Conclusion Suggested that the effects of CBP on proliferation and differentiation of cord blood-derived T cells were similar to that of 20% NBCS1640.

【Key words】cord blood plasma T lymphocyte proliferation differentiation

近年来对于脐血的研究和应用又重新引起人们的重视，国内学者对脐血造血干/祖细胞和脐血血浆（cord blood plasma CBP）进行了大量的基础和临床研究，如脐血细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer,CIK）、细胞毒T淋巴细胞（cytotoxicity T lymphocyte,CTL）细胞等的体外扩增及其杀伤活性的研究[1-2],CBP输注治疗再生障碍性贫血[3]，CBP用于恶性血液病患者化疗后骨髓造血重建的研究等[4]。但CBP用于脐血源性T淋巴细胞培养的研究鲜有报道。本研究采用细胞培养、二甲基四氮唑盐（3,(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）、透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）等方法，观察CBP对PHA诱导的脐血源性T淋巴细胞分化和增殖的影响，为CBP的应用和T淋巴细胞的体外扩增、培养提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

脐血取自济宁市人民医院产科；RPMI1640（美国GIBCO）；MTT、甲基纤维素450、PHA（美国Sigma）；新生小牛血清（杭州江滨生物技术有限公司）； CD3、CD4、CD8单克隆抗体以及免疫组化PV试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）； Ficoll淋巴细胞分离液（上海荣盛生物试剂厂）； Mk3型酶标仪（上海热电仪器有限公司）；H-7500型透射电子显微镜（日本）； CMIAS多功能真彩病理图像分析系统（北京）。

1.2 脐血采集

足月顺产新生儿，在距新生儿脐部5～7 cm处，用血管钳钳紧脐带，在两钳中间断脐，包扎处理新生儿脐带后，放开胎盘侧脐带游离端的止血钳以便收集脐血，用16号针头的50 ml注射器刺入脐静脉，吸取脐血约50 ml，注入含抗凝剂的100 ml无菌瓶中，轻轻摇匀，每个胎盘的脐血作为一个单位，共收集6份脐血。整个过程均无菌操作。6 h内分离出单个核细胞。

1.3 脐血单个核细胞的分离纯化[5]

按文献[5]方法分离脐血单个核细胞，并收集脐血血浆。调整细胞浓度为5×106/ml；用0.4%苔盼蓝检查活细胞，计数200个细胞，观察染深蓝色核的细胞（死细胞），求出百分比，活细胞比例均在95%以上。

1.4 脐血血浆的制备

将收集的脐血血浆混合，1 500 r/min离心10 min，取上层血浆，置-20℃冰箱内冷冻24 h以上，然后4℃融化24 h，2 000 r/min离心15 min，去除冷沉淀；0.4 μm滤膜过滤除菌后分装,-20℃保存备用。

1.5 T淋巴细胞的诱导、增殖和分化实验

实验前涂片，4℃冷丙酮固定，-20℃冰箱保存，留做CD3、CD4、CD8免疫表型检测；取24孔培养板，分为CBP+PHA和PHA两个实验组，每组6个复孔。每孔加入0.5ml单个核细胞悬液，总量为1 ml。CBP+PHA组加0.1 mlPHA液+0.4 ml含CBP；PHA组加0.1 ml PHA液+0.4 ml 含20%新生牛血清的1640培养基。均在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养72 h。培养结束后取部分细胞做透射电镜样品，部分细胞做CD3、CD4、CD8表型检测。

1.6 脐血T淋巴细胞增殖的检测

调整细胞浓度至2×106/ml。取96孔培养板，分CBP+PHA和PHA两个实验组，6个复孔/组。加入100 μl细胞悬液/孔，总量200 μl。CBP+PHA组：PHA液20 μl+ 80 μl CBP；PHA组：PHA液20 μl+80 μl含20%新生牛血清的1640。设同时设生理盐水对照组。在37℃、含5%CO2饱和湿度培养箱内培养72 h。培养结束前4 h，每孔加入5 mg/ml的MTT液孵育4 h；加入三联液100 μl，用封口膜封好培养板，37℃过夜使甲结晶溶解；选择测定波长为570 nm，校正波长为630 nm，用酶联免疫检测仪测各孔光吸收值（OD值），记录结果。两波长OD值相减作为最终OD值，按下列公式计算增殖指数：

增殖指数（SI）=实验组OD值/对照组OD值×100%

1.7 免疫组织化学染色法(immunohistochemical staining,IHS)测定诱导T淋巴细胞亚群

收集诱导后细胞滴于印孔载玻片上，自然干燥后用4℃冷丙酮固定；3%H2O2-甲醇37℃孵育10 min，以封闭过氧化物酶；分别滴加鼠抗人CD3、CD4、CD8单抗，4℃过夜；滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育20 min；DAB显色，室温5～15 min；封片，镜检。高倍镜下随机选取视野，计数200个细胞，细胞膜表面有棕色标记物为阳性细胞，计算出阳性率。

1.8 统计分析

采用SPSS13.0统计软件包处理，所有数据以均数±标准差（x±s）或百分率（%）表示，总体采用方差分析（F检验），多个样本两两比较采用SNK法，以P

2 结果

2.1 光镜下形态观察

光镜（light microscope,LM）下，脐血单个核细胞，呈圆球形，细胞饱满，折光性强。培养72 h，可见大部分细胞成悬浮生长，聚集成团。PHA组细胞团密集、呈较规则球形；CBP+PHA组细胞团较松散，形状不规则。

2.2 MTT比色法检测不同试验条件对脐血源性T淋巴细胞的增殖作用

不同实验条件下培养72 h T淋巴细胞增殖指数：PHA组（1.48±0.49），CBP+PHA组（1.21±0.29）与生理盐水组比较均有统计学意义（P0.05）（表1）。

表1 MTT比色法检测不同试验条件对脐血源性T淋巴细胞的

增殖作用(x±s)

* vs control P

2.3 免疫组织化学染色与图像分析

T淋巴细胞CD3、CD4、CD8分子呈棕色，均表达于T淋巴细胞膜上。不同实验条件诱导第72 h时 CD3、CD4、CD8的阳性表达率：CBP+PHA组CD4、CD8阳性率与PHA组比较均有统计学意义（P0.05）（表2）。

表2 不同实验条件诱导72hT淋巴细胞CD3、CD4、CD8的阳性表达率（%）

* vs control P0.05； vs PHA P

3 讨论

CBP含有丰富的造血刺激因子，能有效扩增脐血造血干/祖细胞并提高脐血中粒细胞巨噬细胞集落形成单位(colony-forming unit-granulocyte macrophage,CFU-GM)增殖能力[6] ，增强骨髓造血干/祖细胞的自我更新和增殖能力[7]。临床上已应用CBP这一特性治疗再生障碍性贫血，并取得了较好的疗效，同时CBP对白血病也有一定的辅助治疗作用[8]。彭晓等[9]等发现在免疫效应细胞CD3单抗激活的杀伤细胞（anti-CD3 antibody induced activated killer,CD3AK）的培养中混合CBP与成人AB血清具有相似的效果，故利用混合CBP培养脐血源性T淋巴细胞的设想具有一定的可行性。且脐血血浆获取方便、ABO 血型抗原性弱，如能取代人工合成的培养基进行细胞培养，不仅能变废为宝、节省资源，还可望能提高免疫细胞增殖能力和杀伤活性，增强过继免疫治疗效果。我们的研究结果初步显示混合脐血血浆对脐血源性T淋巴细胞增殖影响不明显，可能与RPMI1640培养体系具有相似的效果，但其诱导的CD4+、CD8+ T淋巴细胞低于PHA组，其原因有待于更进一步的研究。

参考文献

[1] 周永春.脐带血单个核细胞体外诱导成CIK细胞及其抗肿瘤效应的实验研究[D].昆明医学院,2004.

[2] 何跃东,彭芝兰,刘兴会,等.脐血来源的细胞毒性T淋巴细胞对人卵巢癌裸鼠移植瘤治疗的研究[J].实用妇产科杂志,2005,21(5):287-289.

[3] 王晓阳,李熙鸿,王世有.脐血血浆辅组环胞霉素A治疗再生障碍性贫血临床观察[J].中国煤炭工业医学杂志,2002,5(11):1091.

[4] 张学忠,王秀华,徐燕丽,等.脐血血浆输注对急性白血病患者化疗后血象的影响[J].白血病,2000,9(5):283-284.

[5] 李荣平,季凤清,孙海梅等.人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经院的实验研究[J].解剖学报,2007,38(2):148-152.

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[7] Carow CE,Hangoc G,Broxmeyer HE,et al.Human multipotential progenitor cells (CFU-GEMM)have extensive replanting capacity for secondary CFU-GEMM:an effect enhanced by cord blood plansma[J].Blood,1993,81(4):

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[8] 张学忠,徐燕丽,田韧.脐血血浆的研究及应用[J].临床血液学杂志,2003,16(1):39-40.

[9] 彭晓,张宏文,张文.混合脐血血浆用于CD3AK细胞培养的研究[J].临床血液学杂志,2000,13(3):131-132.