超滤法测定冬凌草甲素的血浆蛋白结合率

[摘要] 目的 测定冬凌草甲素在健康人血浆、大鼠血浆和家兔血浆中的蛋白结合率，为设计合理的给药方案提供依据。 方法 采用超滤法结合高效液相色谱法（HPLC）对冬凌草甲素与大鼠、家兔和健康人血浆的蛋白结合率进行测定。 结果 冬凌草甲素在覆盖临床给药范围的5.4，21.6和108.0 μg/mL下与健康人血浆的血浆蛋白结合率分别为80.6%，78.3%，76.2%，与大鼠的血浆蛋白结合率分别为69.3%，67.5%，68.1%，与家兔的血浆蛋白结合率分别为65.2%，66.7%，64.3%。覆盖临床给药浓度的3个浓度的冬凌草甲素在同种血浆中血浆蛋白结合率差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 结果表明本法简便快速、灵敏度高、专属性好，能够满足测试生物样品的要求，超滤法结合高效液相色谱法可用于冬凌草甲素血浆蛋白结合率的检测。在本研究试验浓度范围内，冬凌草甲素的血浆蛋白结合率与药物浓度无显著相关性，不同种血浆的蛋白结合率试验结果表明，冬凌草甲素与健康人血浆、大鼠血浆和家兔血浆蛋白均具有中等强度的结合。

[关键词] 冬凌草甲素；血浆蛋白结合率；超滤法；HPLC

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（a）-0025-03

冬凌草甲素（oridonin）是唇型科香茶菜属植物冬凌草Rabdosia rubescens（Hemsl.） Hara.中提取的一种贝壳杉烯二萜类化合物，具有较强的抗肿瘤活性，对人胃癌SGC-7901细胞、食道癌109细胞、肝癌BEL-7402细胞等多种肿瘤细胞均呈现较好的抑制作用，而对正常细胞毒性较低[1]。目前临床多用于食管癌、贲门癌、肝癌、食道癌和胰腺癌的治疗[2]。虽然冬凌草甲素抗肿瘤作用显著，但由于冬凌草甲素的水溶性差[3]、半衰期短、生物利用度低和在水溶液中稳定性不好[4]等原因，其临床应用受到限制，目前临床上使用较广的仅有“癌得宁注射液”，癌得宁注射液通过使用表面活性剂和有机溶剂来增大冬凌草甲素的溶解度，达到临床给药浓度，但制剂刺激性大，长期使用容易引发静脉炎等不良反应[5]。为解决上述问题，国内外已开展多种新剂型的冬凌草甲素注射给药研究[6-8]。药物血浆蛋白结合率对于设计合理的给药方案和新药安全评价具有重要意义[9-12]，本文测定了冬凌草甲素在健康人血浆、大鼠血浆和家兔血浆中的血浆蛋白结合率，为冬凌草甲素新型制剂的研发奠定实验基础。冬凌草甲素稳定性不好，为了避免冬凌草甲素溶液在进行血浆蛋白结合率试验时长时间放置降解对研究结果造成误差，本文采用超滤法进行冬凌草甲素血浆蛋白结合率的研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱系统（美国安捷伦公司）；XW-80A旋涡混合仪（上海医科大学仪器厂）；Beckman Allegra 64R高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DSHZ-300型水浴恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂）；Anke TGL-16G型飞鸽离心机（上海安亭科学仪器厂）；Millipore 10K超滤管（美国密理博公司）。

1.2 试药

冬凌草甲素（成都兰贝植化科技有限公司，批号：100822，含量不低于98%））；冬凌草甲素对照品（含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号：110721-200501），色谱纯甲醇（山东禹王实业有限公司），水为超纯水，ProElut C18 SPE小柱（200 mg，3 mL，DIKMA公司），其他试剂均为分析纯。大鼠、家兔血浆（自制，实验动物由中国医科大学动物实验中心提供），健康人血浆（由中国医科大学附属第一医院提供）；本研究由中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准，健康志愿者试验前签署知情同意书。

2 方法与结果

2.1 分析方法建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱： Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（55∶45）；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；检测波长：240 nm；进样量10 μL；理论塔板数按冬凌草甲素色谱峰计大于3000，保留时间约为7.2 min，色谱图见图1。

图1 空白血浆（A）和冬凌草甲素血浆样品（B）的色谱图

2.1.2 对照品溶液的配制 精密称定冬凌草甲素对照品10.8 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，即得浓度为1.08 mg/mL的冬凌草甲素储备液，4℃冰箱冷藏备用。

2.1.3 样品前处理方法 先用2 mL甲醇活化固相萃取小柱，再加入2 mL水平衡小柱，然后注入200 μL超滤液进行固相萃取前处理，上样，先冲洗1 mL水，控制流速3 mL/min，弃去洗脱液，吹干，然后加入1 mL甲醇，控制流速3 mL/min洗脱，收集洗脱液于37℃氮气流吹干，以200 μL甲醇-水（55∶45）溶解即得。

2.2 冬凌草甲素分析方法考察

2.2.1 专属性 依据“2.1.1”项下色谱条件进样分析，冬凌草甲素色谱峰的保留时间为7.2 min，在此条件下，血浆中其他成分对冬凌草甲素的测定无干扰。

2.2.2 标准曲线和线性范围 分别精密量取冬凌草甲素储备液适量，氮气流吹至近干，分别加入不同种属血浆制成浓度为1.08、5.40、21.60、540.00、86.40、129.60 μg/mL的对照品溶液。摇匀后按照“2.1.1”项下色谱条件测定供试液，以冬凌草甲素色谱峰面积为横坐标，浓度为纵坐标进行线性回归。回归方程见表1。结果表明，冬凌草甲素在不同种血浆中在1.08～129.60 μg/mL范围内呈线性关系，定量下限为0.02 μg/mL。

表1 冬凌草甲素在不同血浆中的标准曲线及线性范围

2.2.3 回收率与精密度 分别在不同种属的血浆中加入冬凌草甲素储备液配制成高、中、低3个浓度的标准样品溶液（使血浆中分别含5.4、21.6、108.0 μg/mL），按“2.1.3”项下进行样品前处理，按“2.1.1”项下进行测定，计算回收率。在同天内连续进样5次计算日内精密度，在1周内连续测定3 d计算日间精密度。结果表明，冬凌草甲素在不同种属血浆中的回收率均在90%～105%范围内，平均（98.3±1.5）%，结果见表2。方法的精密度良好，血浆样品在5.4、21.6和108.0 μg/mL 3个浓度的日内精密度和日间精密度的相对标准偏差（RSD）均小于15%（RSD = 2.13%），符合生物样品分析方法要求。

表2 不同种属血浆中冬凌草甲素的相对回收率（%，x±s，n = 6）

2.2.4 稳定性 为考察冬凌草甲素在血浆样品液中的稳定情况，分别配置含5.4、21.6、108.0 μg/mL 3个浓度的冬凌草甲素健康人血浆、家兔血浆和大鼠血浆样品液。置于4、25和37℃下放置，在0、1、2、4、8、12、24 h取样，按照前述方法处理分析，考察不同种属的冬凌草甲素血浆样品在不同温度下的稳定性，结果见表3，冬凌草甲素在不同种属的血浆中在4、25和37℃下24 h内RSD变化均不超过5%，样品基本稳定。

2.3 血浆蛋白结合率实验

取新鲜人、大鼠、家兔血浆分别加入冬凌草甲素标准品溶液配成5.4，21.6和108.0 μg/mL的冬凌草甲素血浆液。涡旋混匀，置于37℃恒温振荡器中温育2 h。取500 μL含药血浆液装入超滤管2000 g离心15 min制备超滤液，全程4℃控温。另取出200 μL各浓度的样品液用来测定不同血浆中冬凌草甲素的总浓度。将总样品液和超滤液按照“2.1.3”项下处理样品，洗脱液在37℃下用氮气流吹干，加入200 μL甲醇-水（55∶45）溶解定容，按照“2.1.1”项下的色谱条件测定血浆液和超滤液中冬凌草甲素的浓度，通过下述公式计算冬凌草甲素与血浆蛋白的结合程度：结合率（%）=[100-100×（缓冲液药物浓度/血浆药物浓度）]×100%，结果见表4。冬凌草甲素与不同种属的血浆蛋白结合率结果表明，在试验浓度范围内冬凌草甲素与人血浆蛋白结合率高于大鼠和家兔的。冬凌草甲素与健康人血浆、大鼠血浆和家兔血浆的平均血浆蛋白结合率分别78.4%、68.3%和65.4%，冬凌草甲素与血浆蛋白具有中等强度的结合能力。不同浓度的冬凌草甲素在同一种属的血浆中的血浆蛋白结合率差异无统计学意义（P > 0.05），说明在本次试验研究的浓度范围内，冬凌草甲素蛋白结合率与药物浓度无显著相关性。

表4 冬凌草甲素在不同种属血浆中的蛋白结合率（%）

3 讨论

冬凌草甲素水溶液的稳定性并不好，长时间处于溶液状态会引起冬凌草甲素的降解而对结果造成影响[4]。目前平衡透析法和超滤法是较为常用的测定药物血浆蛋白结合率的方法。其中平衡透析法平衡时间较长，通常需在37℃放置16～48 h以达到扩散平衡，不适用于稳定性不好的化合物。因此本研究采用超滤法测定冬凌草甲素的血浆蛋白结合率。同时参照有关文献[7]，采用覆盖临床给药范围的有效浓度5.4，21.6和108.0 μg/mL进行健康人血浆、大鼠血浆和家兔血浆中血浆蛋白结合率研究。

进行超滤法测定血浆蛋白结合率的研究，依据超滤液体积与总体积之比的适宜范围在0.3～0.6的标准，本研究进行了冬凌草甲素和血浆蛋白结合达到平衡的时间考察，结果表明将含药血浆样品在37℃下孵育2 h，冬凌草甲素与血浆蛋白可达到结合平衡。超滤条件定为在4℃下2000 g离心15 min。依据此法制备的含药血浆样品中冬凌草甲素的回收率为（98.3±1.5）%，RSD为2.13%，超滤管滤膜对样品的吸附作用可忽略不计。

药物进入体内后与血浆蛋白结合并达到动态平衡，其中发挥药理作用的是游离态的药物。因此测定药物血浆蛋白结合率对其临床应用有重要意义。本研究测定了冬凌草甲素在健康人血浆、大鼠血浆和家兔血浆中的蛋白结合率，为临床和实验研究冬凌草甲素提供实验依据。冬凌草甲素在本试验测定浓度范围内与健康人血浆、大鼠血浆和家兔血浆蛋白有中等强度的结合，但冬凌草甲素属细胞毒类药物，临床上如果与血浆蛋白结合率高的药物同用时，要注意血浆蛋白结合位点的竞争可能导致冬凌草甲素游离浓度增高而引起不良反应。

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（收稿日期：2013-01-30 本文编辑：卫 轲）