[生物]转基因植物中标记基因的剔除

目前植物转基因技术中的dna递送(即将外源 dna片段插入到植物基因组的转化)过程都是在组织水平上进行，转化后的植物组织中只有一部分细胞的基因组整合进了外源dna，所以同时还存在着未转化的细胞。通常用标记基因将转化细胞从未转化的细胞中筛选出来。常用的标记基因大多是一些对抗生素或除草剂的抗性基因。当用它与关注基因共转化植物细胞时，就可以为植物细胞提供在含有抗生素或除草剂的培养基上生长的能力，而未转化细胞不能在这样的培养基上生长，因此存活下来的细胞就只有转化细胞。但是，标记基因并不参与植物的性状改良，在完成筛选后它在植物中的存在便是多余的。这种多余的基因会带来一些负效应。首先，在转化细胞的筛选过程中，大量生长受到抑制的未转化的细胞会阻碍转化细胞对营养物质的吸收，并且还可能分泌一些有毒的物质抑制转化细胞的生长。其次，用重转化(re-transformation)方法进行基因堆积(gene stacking)时，每一次转基因的插入都需要进行转化筛选；但可用于植物转基因筛选的标记基因只有少数几个，不能满足重转化对多个标记基因的要求，因此只能在一次转化后从植物基因组中剔除标记基因，以便下一次转化时使用同一个标记基因。然而，标记基因最令人关注的方面还在于其潜在的“流动”——基因的水平转移与基因逃逸可能产生的生物安全性问题：作为标记基因的抗生素抗性基因一旦流动到危害人类健康的微生物中就会为其提供抗药性，而除草剂抗性基因如果流动到危害粮食作物生长的杂草中就会使其获得除草剂抗性而成为“超级杂草”。所以，标记基因的剔除(selectable marker-free，smf)已成为了转基因植物研究中的新课题。

根据不同原理，剔除标记基因的方法可以分为两类：分离剔除和重组剔除。前者是通过标记基因与关注基因分别插入到植物基因组的非连锁位点上，再经减数分裂实现标记基因与关注基因的分离，而达到标记基因剔除的目的。后者是将标记基因构建在dna裁剪单元中，由起裁剪作用的酶(重组酶或转座酶)识别并切除裁剪单元，从而将标记基因从植物基因组中剔除。本文对这两种方法分别进行阐述。

1 标记基因的分离剔除法

1.1 原理

以土壤农杆菌的t-dna为基因转移载体的转化中，标记基因与关注基因以紧密连锁的方式构建在一个t-dna单元中，因此两者总是共整合进植物基因组中，从而很难通过在减数分裂的细胞中的基因的自由组合或交叉互换相互分离。要实现转化后标记基因与关注基因的分离，可以将这两类基因分别设计在两个t-dna单元中，使它们分别插入而非共整合到植物基因组中(komari等， 1996)。由于t-dna的插入是随机的，因此插入后的标记基因与关注基因可能分别位于不同染色体上，即非连锁位点上，或位于同一染色体相距较远的位点上；减数分裂后，标记基因与关注基因就可以分离，从而在下一代中获得无标记基因的转基因植物。

1.2 类型

根据所使用土壤农杆菌的种类、ti质粒的种类以及两个t-dna在ti质粒上位置关系的不同，标记基因的分离剔除法可分为5种类型。

(1)分别构建标记基因与关注基因的两个t- dna位于两个ti质粒上，分别用两种土壤农杆菌株共转化植物细胞。

(2)分别构建标记基因与关注基因的两个t- dna位于两个ti质粒上，用一种土壤农杆菌株转化植物细胞。

(3)分别构建标记基因与关注基因的两个t- dna位于同一个ti质粒上，标记基因与关注基因之间由大片段的毒力基因(virulence gene)相隔开。用两组t-dna的边界序列(左，lb和右，rb)，其中，一组界定标记基因，另一组界定关注基因。

(4)分别构建标记基因与关注基因的两个t- dna紧密排列于同一个ti质粒上。

(5)将标记基因与关注基因设计在带双右边界序列(double right border，drb)一个t-dna单元中。作者等(lu等，2001)构建了一个drb的双载体 (binary vector)(图1)，获得带有水稻齿裂矮缩病毒基因组的第5个基因片段s5关注基因的smf转基因水稻，southern blot试验证明，64％的jarrah水稻产生smf子代，而