环介导等温扩增技术联合结核分枝杆菌快速培养在涂阴肺结核中的诊断价值

[摘要] 目的 探讨环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP，新型的核酸扩增技术）联合结核分枝杆菌快速培养（BACTEC MGIT 960，结核分枝杆菌检测仪）在痰涂片阴性肺结核中的诊断价值。 方法 收集疑似肺结核患者90例，随机分成A、B、C组，A组通过指南推荐涂阴肺结核诊断，B组通过LAMP确诊，C组通过LAMP联合BACTEC MGIT 960确诊，并给予抗结核治疗2个月后随访所有入组患者胸部CT变化情况，分别比较涂阴肺结核诊断方法，LAMP及LAMP联合BACTEC MGIT 960的诊断可靠性。 结果 涂阴肺结核指南推荐诊断阳性率40.0%，LAMP阳性率53.3%，联合检测阳性率60.0%，差异无统计学意义。联合检测敏感性88.9%，特异性91.7%均明显升高。 结论 在实际临床中，环介导等温扩增技术联合结核分枝杆菌快速培养（BACTEC MGIT 960）在痰涂片阴性肺结核诊断异性及敏感性高。

[关键词] 环介导等温扩增技术；BACTEC MGIT 960；涂阴肺结核；诊断

[中图分类号] R446.5；R521 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）05-0019-04

目前每年结核病在全球的发病率仍以1%的速度增长，而结核分枝杆菌的耐药性也在增加，中国作为结核病高发的国家，应该提升结核病诊治技术，才可提升诊治结核病的效率[1]。然而，在2010年期间，经第五次全国结核病流行病学抽样调查，结果表明2010年15岁以及以上人群中，发生活动性肺结核发病率达到459/10万比例，而其中涂阳肺结核患病发病率也达到66/10万比例[2]。尽管活动性肺结核及涂阳肺结核的患病率逐年下降，但是总体下降幅度不大，其中一部分原因是菌阴肺结核，Singh M等[3]研究结果表明涂阴肺结核的接触者被感染的几率在7.3%～21.0%，其传染性低于痰培养阳性的肺结核。

尽管肺结核的诊断方法日益增多，针对涂阴肺结核的诊断标准也越来越多，但是仍缺少特异性、敏感性高的有效诊断方法。目前结核病诊断研究比较多的主要是LAMP[4]和BACTEC MGIT 960[5]。本研究主要通过比较涂阴肺结核指南组、LAMP组及LAMP联合BACTEC MGIT 960检测组考虑肺结核患者抗结核治疗2个月后，所有阳性及阴性疑似肺Y核患者各30例随访胸部CT，观察2个月后所有患者胸部CT病灶变化情况，评价环介导等温扩增技术联合结核分枝杆菌快速培养在涂阴肺结核中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料

2015年1～12月于嘉兴市第一医院收集符合标准的影像学疑似肺结核疾病患者，随机从中抽取90例疑似肺结核疾病患者入组研究。临床疑似肺结核疾病患者症状包含：出现慢性咳嗽、连续3周咳痰以及咳痰伴咯血症状，胸部CT检查可见阴影。纳入标准：（1）肺部CT或X线检查疑似肺结核者；（2）3次痰涂片未见抗酸杆菌者；（3）肺部影像学异常且有结核临床症状者；（4）既往无结核病史者；（5）年龄>16岁；（6）意识清醒者；（7）知情同意者。排除标准：（1）排除肺部疾病已诊断明确者；（2）排除存在影响凝血机制疾病者，如血友病、尿毒症、重症肝炎、血小板16岁，平均年龄（35.0±7.1）岁；C组患者男15例，女15例，年龄>16岁，平均年龄（36.0±6.3）岁；三组患者资料对比不存在统计差异（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 临床诊断涂阴肺结核的标准[6] 临床诊断中必须具备的诊断指标：（1）临床诊断中，至少在3份痰标本的涂片镜检中，得出抗酸杆菌为阴性；（2）临床经胸部X线及胸部CT诊断，符合活动性肺结核病变；（3）在临床中，排除患其他非结核性肺部疾病；（4）经病理检查，证实肺部出现结核性改变；（5）应用支气管肺泡灌洗液（BALF）检验，检出支气管以及肺部组织含有抗酸杆菌。临床诊断中的辅助诊断指标：（1）对患者在临床中进行结核菌素（PPD 5TU）皮肤试验，结果为强阳性；（2）进行血清抗结核抗体检验，结果呈阳性；（3）应用PCR加探针检测痰结核分枝杆菌，结果呈阳性；（4）对患者进行病理检查，证实出现肺外组织结核病变。

1.2.2 LAMP 检测肺结核疾病 制备DNA 模板：可以将获取的患者痰标本处理液，转移到1.5 mL EP管内。然后，设置12 000 r/min转速高速离心5 min。之后去除上清液，洗涤2次得到的缓冲液，并加入适量的DNA提取液。最后，将液体混匀后，进行沸水浴10 min，再瞬时离心，将得到的上清液转移到另外一只准备好的EP管中，作为检验模板。

进行LAMP检测操作：可以根据相关文献[7]中的方法，应用gyrB基因进行检验，可以选用gyrB内6个区段的4种引物作为本次检验肺结核疾病的LAMP引物，主要如下所示：

外引物为：F3：5'-ACCACGGAATACGACTTCGA-3'，B3：5'-AGTGAAAGGTGCGGCTCT-3'；内引物为： FIP：5'-GGTCACCCTCTCGTCGGTCAGCAAGAGATGGC-GTTCCTC-3'，BIP：5'-GAAGTGGTCAGCGACGTCGCTAACTTTGTGCGGTGCAGTG-3'。

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（收稿日期：2016-12-17）