农杆菌介导海岛棉遗传转化影响因子的研究

摘 要：农杆菌介导转化法是转基因技术中常用方法之一，但其在介导海岛棉遗传转化方面仍存在转化率较低的主要问题。故本文对农杆菌介导海岛棉遗传转化效率的多因素进行了概述，分别从菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养等多方面进行探讨。同时，对国内农杆菌介导海岛棉领域的研究现状提出了新问题及建议，以期为海岛棉遗传转化体系进一步完善提供参考。

关键词：农杆菌；海岛棉；影响因子

中图分类号： S562 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160132004

农杆菌种类中通常分为四类，即悬钩子农杆菌、根癌农杆菌、放射形农杆菌及发根农杆菌四种[1]。而转化植物细胞的农杆菌仅有两类，即含 Ti 质粒的根癌农杆菌和含 Ri 质粒的发根农杆菌。由于对 Ti 质粒的研究比较详细，而且应用最广泛，所以根癌农杆菌最为常用。农杆菌介导法借以组织培养为基础并进行遗传转化的转基因体系，能够高效地将外源基因整合到棉花基因组中，与其他转基因方式比较，拥有作用原理清楚、操作简便、转化周期短及高效表达等特点，是当前植物转基因工程中最常用的方法。

在棉花转基因技术体系的建立及应用的过程中，农杆菌介导转化是一种重要的研究方法。1987年，Umbeck等第1次利用农杆菌转化方法成功地获得了导入外源基因的棉花，并获得了成功。随后在1994 年，我国研究人员首次建立了海岛棉胚性愈伤组织的转基因体系诱导条件，获得了6个海岛棉品种胚性愈伤组织[2]。在随后的20多年里棉花转基因研究取得较大的进展。本文围绕近20年来在构建海岛棉遗传转化体系过程中常使用的转化方法及其影响因素进行概述，寄希为海岛棉转基因体系的研究提供新思路。

1 农杆菌介导抗虫基因转化海岛棉的研究进展

1.1 海岛棉常用的转化方法

自1983年转基因植物问世以来，经过近20多年的发展，根据转化机制不同，植物遗传转化可分为10多种不同的方法，包括农杆菌介导法、病毒载体法、基因枪法、电激法、显微注射法、花粉管通道法等多种类型。而在棉花中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一。目前，由于根癌农杆菌和发根农杆菌生长迅速，不结球，转化中易操作等，根癌农杆菌和发根农杆菌介导的遗传转化系统常用于研究海岛棉遗传转化体系。

1.2 根癌农杆菌介导的遗传转化系统

根癌农杆菌是存在于泥土中的细菌，属革兰氏阴性菌，它能够趋化性地侵染大多数双子叶植物的受伤部位，从而引发植物的根瘤病。自1997年，Chilton等首次证明根癌农杆菌Ti质粒的一部分可以转入植物细胞并且能够整合到植物染色体上以来，棉花农杆菌介导高效转化体系也随之建立。Sakhanokho等以海岛棉Pima为实验对象，建立了海岛棉的高频率胚性愈伤系，最终得到到了转基因再生植株。2008年贺雅婷[3]获得了成功建立起遗传转化再生体系的新海16号海岛棉品种。2011年，周丽容[4]在以新海30和新海16 建立了转抗虫基因到海岛棉的体系，用下胚轴做外植体，最终得到了抗虫植株。2014年，魏延宏[5]等以多种海岛棉品种的茎尖为受体建立了农杆菌介导海岛棉茎尖遗传转化体系，获得30株含有EPSPS（抗除草剂基因）标记的转基因海岛棉。2015年，李琼等利用正常胚性愈伤作为受体获得可转化植株，同时对较轻畸形胚再培养得到次生胚，最后培育出正常转基因植株，极大缩短了转化周期。由此可见，根癌农杆菌在对海岛棉的遗传转化中起着的至关重要的作用。

2 影响农杆菌介导海岛棉转化效率的因素

农杆菌介导法具体过程包含外植体的切取、侵染、诱导分化、生根发芽及移栽等。据前人实验，海岛棉的再生频率与菌液浓度、侵染时间、预培养时间以及共培养的方法等有关。同时合适的外植体来源对转化的影响也很重要，植物的不同外植体对农杆菌的侵染敏感性差异明显。

2.1 菌液浓度对海岛棉转化效率的影响

在采用农杆菌对棉花受体感染时，合适的农杆菌浓度是必需的，若菌液浓度过低，接菌量不足，则引起共培养时农杆菌生长量少；而菌液浓度过高，共培养时农杆菌会过量繁殖伤害外植体，都会降低抗性苗率。2007年，翁琴[1]等以海岛棉的茎尖为转化对象筛选得到农杆菌液吸光度为0.6～0.8时最佳。魏延宏等在2011年利用新海13 号等茎尖为转化受体时，当菌液浓度为吸光度为0.5 时，最终转基因再生植株的再生率达到96%，且平均抗性率最高，达到46%。李宝平等用5～6d的棉花无菌苗下胚轴为受体，筛选出菌液浓度最佳值（分光光度计5500A，消光系数0.4～0.8），使出愈率达40%～70%。2012年，杨婷等用新海24等无菌苗的下胚轴于OD值为0.5的菌液中浸泡15min亦可获得较高转化率。农杆菌介导不同棉种或不同类型外植体时所需要的菌液浓度有一定差异，但最佳OD值的范围基本都集中于0.4～0.8之间。究其原因可能是不同基因型的研究对象，其对农杆菌的侵染的接受性存在差异。

2.2 菌液浓度对海岛棉转化效率的影响

据研究表明，筛选出研究对象在农杆菌中浸染的最佳时间，有利于避免后续组织培养中导致的菌类污染现象，并可以减缓菌液对外植体的细胞侵蚀及毒性作用。若作用时间太短，农杆菌不能进入受体细胞内，但作用浸染时间过久，植物组织由于在菌液中作用时间太久而缺氧；返菌现象严重，继代培养中外植体褐化现象严重，甚至发黑软腐，导致再生频率较低。在转化工作中选择最佳的侵染时间非常必要。翁琴等在研究海岛棉再生体系时，发现在用农杆菌LBA4404菌株侵染茎尖的最佳时间为 20～30min。赵常燕以冀无2031为材料，用农杆菌侵染15 min，共培养24 h，得到较高转化率。2011年，周丽容以海岛棉下胚轴为外植体用农杆菌菌株LBA4404侵染15min，继代培养1～2个月，产生抗性愈伤率达90%，结果比较理想。在棉花中，用农杆菌侵染陆地棉或海岛棉，最佳侵染时间大多都为10～15min，获得30%～40%的抗性愈伤诱导率，且愈伤长势较好，具有分化为胚性愈伤的潜力。同时，对于海岛棉不同类型的外植体，侵染时间也一致。

2.3 预培养时间对海岛棉转化效率的影响

在农杆菌介导时，外植体细胞的感受态很重要。预培养使外植体生理代谢旺盛并可促进细胞进行多次分裂，而此时的植物组织细胞更易结合并连接外源 DNA。但如果在实验处理中，植物组织伤口渗出液若太多，则难以接种农杆菌，且伤口愈合，农杆菌不能有效侵染。因此，有相关研究表明，共培养前的预培养对转化效率有一定的作用。采取合适时长的预培养，能够增进细胞分裂，使外源DNA更容易浸入和连接。2014年，刘卫民等对棉花胚性愈伤进行15～20d的预培养，获得了丰富的感受态材料，使抗性胚性愈伤再生率均在62%以上。然而，岳建雄等人通过多年研究得出，外植体的下胚轴被切成切段后，要当即被菌液感染、共培养，而不能开展外植体的预培养实验环节。并进一步得出，以胚性愈伤作为外植体时一般需要预培养7～14d，这样可以获得更高的转化率。但以棉花的茎尖和下胚轴作为外植体进行遗传转化时则不需要进行预培养。

2.4 共培养的方法

共培养是农杆菌转基因体系中最为重要的步骤，具体当外植体经过农杆菌浸染后进行暗培养，使农杆菌侵染植物受伤的组织细胞，由此可将带有目的基因的T-DNA整合到外植体基因组中。在共培养时，在培养基表层铺一层滤纸有利于约束农杆菌的过度繁殖，有效避免了浸染组织的褐化死亡。2007年，翁琴用没有滤纸的对照，出现了继代培养后细菌再度污染的现象。2009年，张海平[9]在研究棉花下胚轴基因转化体系时，在培养基上铺上滤纸，使转化时间从48h延长至60h，获得 53株再生棉花，大大提高了转化率。2011年，李杨阳以新海30号下胚轴为受体材料用含有NAC家族基因的农杆菌共培养24h，得到较高转化率。与此同时，周丽容[4]以新海16胚性愈伤组织为受体共培养24h，得到的结果基本相同。魏延宏等在2014年建立海岛棉茎尖遗传转化体系时筛选最佳共培养时间，发现共培养时间在48～72 h之间时平均抗性率提高至41%和44%。

对于在共培养阶是否加添加激素，文献中报道不一。有的不加，有的则认为加激素后可提高转化率。张根义等 1997 年的研究表明：在植物的转基因再生过程中，适当浓度的细胞分裂素和生长素可将增强植物细胞的感受态，从而使整合外援基因效率更高。

3 问题与展望

作为一种天然的植物遗传转化的方法，农杆菌介导的遗传转化技术已成为海岛棉转基因体系的主流方法，其作用机理、转化环节等方面均取得了一定的进展。但目前，农杆菌介导海岛棉转化技术的瓶颈受到农杆菌宿主专一性和受体材料基因型等的限制，导致海岛棉再生转化率较低。另外，在对海岛棉的遗传转化研究中，所取用的外植体基本均是茎尖与下胚轴，对其他方面缺乏研究。因此，今后应进一步开展相关研究工作，在完善转基因条件、扩大转基因规模方面进行深入研究，从而最终获得转化效率较高且易规模化生产的转基因海岛棉体系。

参考文献

[1]周仲华，陈金湘.分子标记技术在棉花遗传育种中的应用[J].江西棉花，2005，27 （4 ）：3-6.

[2]土彦霞，土省芬，马峙英.棉花转基因技术的研究及应用[J].华北农学报，2006，21（增刊）：41-45.

[3]贺雅婷，曲延英，孔庆平，等.海岛棉愈伤组织诱导及分化的影响因素初探[Jl.分子植物育种，2008，6（ 3） ：597-602.

[4]周丽容，陈全家，贺雅婷，等.农杆菌介导海岛棉胚性愈伤高效遗传转化体系的研究[J].新疆农业大学学报，2011，34（4）：317-320.

作者简介：周梦岩（1994-），本科，河南驻马店，新疆农业大学学生，农学院生物技术专业；苏豫梅（1983-），硕士，河北博野人，新疆农业大学农学院生物技术系教师，研究方向：棉花分子生物学。