快速PCR方法在金银花真伪鉴别中的应用

[摘要]建立简单快速的金银花真伪分子鉴别方法。该研究依据金银花trnL-trnF 625位G/T SNP位点设计快速位点特异性PCR引物，优化位点特异性PCR条件，对金银花及其9种混淆品进行扩增及检测。当在87 ℃预变性1 min；87 ℃变性5 s，68 ℃延伸5 s，30个循环时，通过加入SYBR Green I染料染色，金银花样品显绿色荧光，混淆品无荧光。整个PCR反应可在30 min内完成。该研究结果说明快速位点特异性PCR能简单快速鉴别金银花及其混淆品。

[关键词]快速PCR；金银花；分子鉴定；荧光检测

自Millus等1985年发明PCR技术以来，PCR已成为分子生物学研究中的最基本和普遍手段之一。由于PCR的重要性，为了提高实验效率、节约成本，对该技术的改良从未停止过。早在1991年，Yap等[1]通过更改PCR条件以缩短PCR反应时间。而Wittwer等[2-3]通过使用毛细管进行PCR反应，即利用热空气注入法快速控温，从而减少升降温的时间，使得30个PCR循环可以在30 min内完成[4]。在此基础上，提出了快速PCR（rapid PCR）的概念。

准确、快速是中药分子鉴别的核心需要。目前已报道的中药分子鉴别方法，如RAPD，SSR，SCAR，PCR-RFLP，AS-PCR，AFLP及DNA条形码等均依赖于PCR技术[5-6]。快速PCR与其相结合，将缩短PCR反应时间、提高效率，有利于中药分子鉴别技术的现场运用和推广。

本文基于已建立的金银花位点特异性PCR真伪鉴别方法[7]，对PCR的反应程序进行了优化，并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行检测，结合药材DNA快速提取技术[8]，可将金银花真伪分子鉴别时间控制在30 min左右，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。

1 材料

1.1 药材 选取来自于不同产地的8个忍冬正品及9种16个忍冬属伪品材料进行快速位点特异性PCR研究。植物样品采自广西、河南、山东、北京、安徽地区，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心和广西药用植物园，见表1。

1.2 仪器 GeneAmp 9700型PCR扩增仪（Applied Biosystem公司）；5810 R型高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；VORTEX-2 GENIE漩涡震荡仪（Scientific industries 公司）；DYY-12 型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）；HE99X-15-1.5型电泳槽（Hoefer公司）；SYNGENE凝胶成像系统（GENE公司）；ZF-7A型手持式紫外灯（上海谷村电子光学仪器厂）。

1.3 试剂 琼脂糖购自Promega公司；溴化乙啶购自Fluka公司；rTaq DNA聚合酶、Ex Taq聚合酶、SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、2 000 bp DNA Marker购自TaKaRa公司；AptaTaq fast DNA 聚合酶Mix购自Roche有限公司、Transfast Taq DNA聚合酶购自Transgen有限公司；10 000×SYBR购自Invitrogen公司；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 快速位点特异性PCR引物设计 此前，本课题组已验证金银花trnL-trnF序列625位G/T变异可以准确鉴别金银花及其同属伪品[7]，本文据此位点设计快速PCR鉴别引物。通过Premier Primer 5.0（http：///primerdesign/）设计快速位点特异性PCR引物，调整参数使上游引物为3′末端与625位G/T的SNP位点互补，Tm值为65～70 ℃，在引物3′末端倒数第二位引入人为错

确定快速位点特异性PCR反应条件。20 μL PCR反应体系包含2 μL 10× rTaq buffer，1 μL 10 mmol・L-1 dNTPs，0.25 μL 10 μmol・L-1上游及下游引物，0.5 U 快速Taq酶，1 μL 20% PVP 40溶液，0.5 μL 10 g・L-1 BSA溶液，1 μL（约10 ng）DNA模板。PCR反应在9700型PCR扩增仪上进行。由于Yap等报道94 ℃预变性1 min即可实现全基因组解链[1]，而本课题组前期证实94 ℃预变性1 min可实现PCR产物的有效扩增，依此设定初始反应程序见表2，在此基础上开展PCR反应条件的优化。

反应结束后在PCR反应体系内加入2 μL 100× SYBR Green I（Invitrogen公司），混匀后于365 nm紫外波长肉眼下检测荧光。另取PCR反应产物，加入5 μL 6× Loading buffer （Takara 公司） 混匀后于EB染色的1%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。

利用忍冬SNP鉴别引物LJ-RAPID-1F和LJ-RAPID-1R进行快速位点特异性PCR反应，并分别考察退火温度：66，68，70，72 ℃；PCR循环数：27，30，33个循环；变性温度：95，91，89，87，85，83 ℃；变性和退火时间：10，5，3，1 s；Taq种类：rTaq DNA聚合酶，SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，Apta Taq fast DNA 聚合酶Mix，Transfast Taq DNA聚合酶；不同PCR仪：9700型PCR仪（ABI公司），PTC-100型PCR仪（MJ Research集团），Mastercycler型PCR仪（Eppendorf公司），TC-512型PCR仪（TECHNE公司）对PCR反应稳定性的影响。

2.4 PCR产物检测 在PCR扩增产物中加入2 μL 100× SYBR Green I于365 nm紫外波长下检测荧光，出现强烈绿色荧光则表明有扩增。

3 结果与分析

3.1 碱裂解法提取金银花类材料DNA 由于碱裂解法提取的DNA无法通过凝胶电泳检测[8-9]，故本文使用通用引物进行扩增，以检测DNA提取效果。1%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，利用trnL F/trnF R引物，忍冬及其9个同属混淆品均获得约1 050 bp大小的扩增产物，与trnL-trnF片段大小一致见图1，说明碱裂解法提取的DNA可以满足PCR反应的要求。

3.2 PCR反应条件的确定 与AS-PCR一样[7， 10]，快速位点特异性PCR要求严格的退火温度、循环数，循环数过高或退火温度过低均会导致假阳性的分型结果。为获得最适反应条件，本文依次分析了退火温度、循环数、变性温度、变性和退火时间、Taq酶种类及不同的PCR仪对PCR反应稳定性的影响。结果表明，使用快速AS-PCR鉴别引物扩增时，如当退火温度为66 ℃时，伪品也有荧光。当退火温度为70，72 ℃时，均无荧光。当退火温度为68 ℃时，仅正品有荧光，所以本文金银花快速AS-PCR鉴别的最佳退火温度选择68 ℃，见图2中A。

减少PCR反应时间，在退火温度为68 ℃，逐渐减少循环数。当循环数为27个循环，PCR产物出现弱荧光，见图2中B。然而，当选用27个循环时，变性-退火/延伸的时间低于20 s时即无法扩增出条带，故最终选择循环数为30。

在此基础上，变性温度高于85 ℃（图2中C），变性及退火时间大于3 s（图2中D）才能有效鉴别金银花真伪品。随着变性温度的降低，PCR成功率降低，当变性温度低于85 ℃时无法获得PCR产物，该结果与Yap等[1]的报道一致。变性及退火时间同样对扩增成功率有着重要影响，退火时间超过3 s才能获得有效的扩增，这可能与PCR起始过程中

DNA聚合酶结合模板-引物复合物需要时间有关。由于不同PCR仪温度会有所差异，升降温时变温所需时间有所差别，为增加快速PCR鉴别金银花的适用性，本研究最终选定变性温度为87 ℃，退火时间为5 s用于金银花鉴别。

在所选择的4种DNA聚合酶中，3种快速DNA聚合酶SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、Apta Taq fast DNA 聚合酶Mix，Transfast Taq DNA聚合酶均能实现金银花真伪鉴别（图2中D）。对金银花快速PCR不同PCR仪扩增时的稳定性进行考察，结果表明，PCT-100，ABI 9700，TC-512型PCR仪均可用于金银花快速PCR鉴别（图2中F）。而Mastercycler型PCR仪未获得扩增，可能是由于其完成PCR所用时间太短（18 min），升降温速度太快，反应不完全引起的。

3.3 快速位点特异性PCR鉴别金银花 使用快速AS-PCR对金银花及其9种同属伪品进行扩增，PCR扩增条件为87 ℃预变性1 min；87 ℃变性5 s，68 ℃延伸5 s，30个循环。反应结束后在扩增产物中加入2 μL 100× SYBR Green I于365 nm紫外波长下检测荧光。金银花正品显示出明亮绿色荧光，而伪品不发出荧光，取5 μL进行凝胶电泳，仅金银花扩出约100 bp大小的条带，伪品无条带，见图3。

4 讨论

4.1 金银花快速PCR反应的实现 经典的DNA分子鉴定过程一般包括DNA提取、目标核酸或目标信号的扩增和产物检测3个方面。为达到快速鉴定的目的，须尽量缩短这3步的时间。DNA提取是制约DNA分子鉴定用时的首要因素，传统的CTAB法或SDS法一般需4 h以上才能获得DNA，试剂盒常用的硅胶柱法一般需要1～2 h才能获得DNA，并且需要进行反复离心，操作繁琐，难以满足快速鉴别的要求。故本研究采用了碱裂解法进行DNA提取，由于碱裂解法只有裂解和中和2步，DNA提取用时大约5 min。研究结果表明，碱裂解法适用于金银花及其伪品DNA提取，所得DNA满足分子鉴定要求。

制约DNA分子鉴定的第2个因素是PCR扩增过程，常规PCR扩增一般需时2～3 h，主要是进行30～40个循环的变性-退火-延伸需时较长。由于Taq DNA聚合酶延伸速度一般为1～6 kb・min-1，用于鉴定的PCR片段一般约300～1 000 bp，故传统上常选择0.5～2 min的延伸时间，造成扩增反应用时很长。为达到快速扩增的目的，PCR产物长度应尽可能短，故本文进行金银花鉴别引物设计时，设定引物距SNP鉴别位点上下游1～30 bp，所得PCR产物≤100 bp。另一方面，减少PCR循环过程中升降温的温差，采取两步法进行PCR扩增，也可以缩短PCR的反应时间。为减少升降温用时，本文设计的引物Tm与延伸温度基本一致。Yap等的研究表明，PCR产物变性远较全基因组变性容易，极端情况时92 ℃下1 s即可实现短产物变性[1]，所以本文首先尝试降低变性温度以减少升降温温差，最终发现87 ℃时达到金银花PCR产物变性的临界点，选择该温度用于金银花分子鉴定。在此基础上，逐步缩短变性-退火/延伸的时间，最终达到了快速扩增的目的。

经典的PCR产物检测方法为凝胶电泳方式，需要经过制胶、胶凝、电泳和成像4步，需用时1 h以上。当使用SYBR Green I荧光染料时，产物检测过程为染色、成像2步，用时约2 min，极大缩短了检测时间。

本文通过利用常规PCR仪，建立了金银花真伪快速PCR鉴别技术，并结合药材DNA快速提取技术和荧光检测技术，有望在短时间内完成药材分子鉴别过程，且仅需PCR仪、操作简单，为中药材分子鉴别技术的推广和应用提供技术保障。

4.2 快速PCR在中药分子鉴定应用的展望 随着PCR技术的快速发展，研究者对检测时间有了越来越高的要求，希望在保证PCR反应灵敏度和特异性的条件下尽可能缩短PCR时间、提高检测效率，快速PCR技术应运而生。快速PCR技术在临床检验和司法检测中已有广泛应用[11-16]，然而目前尚未见到快速PCR用于中药鉴定的报道。

建立准确、快速、高通量、低成本的鉴别方法一直是中药鉴定的追求[17]。相对传统性状和理化鉴别来说，基于PCR的分子鉴别操作相对复杂、耗时相对较长，制约了中药分子鉴别的应用和推广。与经典PCR相比，快速PCR的程序更为简单，检测速度明显提高，基本能满足中药快速、准确鉴别的要求，在中药分子鉴别中具有良好的应用前景。

建立快速PCR检测方法主要包括以下几种策略：改变PCR程序，即缩短变性-退火-延伸的时间[3， 18]。提高酶与模板的亲和力，即缩短PCR启动时间、提高Taq酶延伸速度。改进PCR仪的升降温速度，即增加热传导率[19]。改变PCR进行方式，即在硅基芯片上实现微池静态PCR[20]或平流PCR[21]。由于目前商品化的快速Taq酶已经很成熟，而常规PCR仪在今后较长一段时间内仍会是主流仪器，因此通过优化PCR程序，在常规PCR仪上进行快速PCR将成为中药快速PCR鉴别的一个研究方向。而便携式PCR仪的问世及其商业化[22-23]，将促进在野外、药市或药房进行PCR分子鉴定，此时PCR反应和产物检测时间可能会成为制约DNA分子鉴定的瓶颈。快速PCR的实现，能提高单位时间检测通量，促进现场检测技术的发展和应用。

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Rapid PCR authentication Lonicera japanica

JIANG Chao1，2， HOU Jing-yi1， HUANG Lu-qi2， YUAN Yuan2*， CHEN Min2， JIN Yan2

（1.Institute of Resource Ecology and Traditional Chinese Medicine Resources， Beijing Normal University， Beijing 100875， China；

2. State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] To simply and rapid authenticate Lonicera japanica. Rapid allele-specific PCR primer was designed base on trnL-trnF 625 G/T Single nucleotide polymorphism and the PCR reaction systems including annealing temperature was optimized； optimized results were performed to authenticate L. japanica and its 9 adulterants. When 100× SYBR Green I was added in the PCR product of 87 ℃ initial denatured 1 min；87 ℃ denatured 5 s，68 ℃ annealing 5 s，30 cycle； L. japanica visualize strong green fluorescence under 365 nm UV lamp whereas adulterants without. The results indicate rapid allele-specific PCR could authenticate L. japanica and its adulterants rapidly and simply.

[Key words] rapid PCR； Lonicera japonica； molecular authentication； fluorescence

doi：10.4268/cjcmm20141902