大鼠非酒精性脂肪肝中UCP2动态表达研究

[摘要] 目的 探讨大鼠非酒精性脂肪肝中ucp2的动态表达，进一步明确其在非酒精性脂肪肝中的发病机制。 方法 选取大鼠60只进行实验，按照随机分组原则划分为观察组和对照组，观察组采用高脂饮食进行脂肪肝诱导，采用免疫组织学技术和Western blot技术对大鼠肝组织中的UCP2进行检测，对大鼠的血清甘油三脂（TG）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和游离脂肪酸（FFA）含量进行检测。 结果 大鼠在形成非酒精性脂肪肝过程中，体内UCP2阳性细胞的含量以及TG、ALT、FAA的表达和含量都会显著增加，在高脂饮食诱导8～12周期间最为明显。 结论 大鼠非酒精性脂肪肝的形成与发展程度与体内UCP2表达强度呈正比例关系，UCP2的酶活性增高会导致促进脂质过氧化反应，促进脂肪肝的形成。

[关键词] 非酒精性脂肪肝；UCP2；动态表达

[中图分类号] R575.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）16-25-03

非酒精性脂肪肝，是一种无过度饮酒史，由于肝细胞内脂肪存积或变性所导致的临床病理综合征。近年来，随着人们生活水平的不断提高，对高脂肪类食物的摄入增多，非酒精性脂肪肝的发病几率也呈现出逐年上升的趋势，并最终发展成为终末期肝病或肝硬化，对患者健康和生活造成严重影响，且当前仍没有有效的治疗药物[1]。解耦联蛋白2（UCP2）是一种位于线粒体内膜上的载体蛋白，具有解偶联的作用，可以发挥脂质调节的作用，但当UCP2的表达增加时，却同时对机体产生不良的作用，在非酒精性脂肪肝的形成发展过程中具有重要的调节作用[2]。为了探讨两者之间的关系，本研究选取大鼠建立非酒精性脂肪肝模型实验，对UCP2的动态表达变化进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本医院动物中心的成年、雄性大鼠60只进行研究

（合格证号：1003046），体重150～200g，首先全部采用普通饲料喂养1周。按照随机分组原则将60只大鼠划分为观察组和对照组各30只。观察组大鼠采用88%基础饲料加10%猪油加2%胆固醇，自由进食和饮水；对照组采用普通饲料进行饲养，两组患者均以12周为1个周期进行饲养[3]。采用分笼饲养的方式对两组大鼠进行饲养，每个笼子6只。两组大鼠分别于饲养2、4、6、8、12周腹腔注射2%戊巴比妥钠1mg/kg进行麻醉，进行腹腔静脉采血，12周时取出肝脏，常规制备血清，将肝脏组织在-70℃下进行低温保存[4]。

1.2 检测指标

采用免疫组织学技术和Western blot技术对大鼠肝组织中的UCP2进行检测，对大鼠的血清甘油三脂（TG）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和游离脂肪酸（FFA）含量进行检测，按照仪器操作步骤进行检测操作，并采用全自动生化分析仪进行检测[5]。

1.3 方法

1.3.1 病理学检测方法 取肝组织进行石蜡切片，进行常规PAS和HE染色处理，对肝细胞的脂肪性变程度进行观察；对冰冻切片UCP2进行化学染色，其表达程度判断标准为：

1个加号表示肝小叶内约1/3的阳性细胞染色，呈浅黄色；两个加号表示肝组织内约2/3的细胞阳性染色，呈棕黄色；3个加号表示肝小叶内有超过2/3的细胞阳性染色，呈棕褐色[6]。

1.3.2 Western blot技术 取右肝组织200mg，加入含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，在4℃环境在采用1000r/8min离心机进行离心15min，取上清蛋白，取50μg蛋白变性，采用聚丙酰胺凝胶电泳法进行检测，获得6%脱脂奶粉在室温下封闭1h，UCP2抗体，在4℃环境下进行过夜保存[7]。洗涤后加入辣根过氧化物酶结合抗免IgG，采用化学发光剂进行检测，在X片下进行显影。采用分子生物学图像分析系统对带积分灰度值进行定量分析，注意所测数据需要扣去背景积分光密度[8]。

1.4 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行统计，组间比较采用t进行检验，计量资料采用（）进程表示，计数资料采用x2进行检验，P

2 结果

2.2 肝组织病理学变化和免疫组织化学

在光镜下进行观察发现，对照组大鼠的肝组织病理学形态变化正常，观察组大鼠肝组织出现不同程度变性，肝细胞体积增大，且与高脂肪饮食的时间长短呈正相关关系，在2、4、8、12周检测结果不断发展。对两组大鼠进行免疫组织学习化学染色，对照组大鼠几乎未见UCP2阳性肝细胞，高脂饮食观察组大鼠的肝组织中UCP2的分布则较广，主要位于细胞浆中，其分布与肝组织脂肪化的程度呈正相关关系[9]。见图1。

3 讨论

解耦联蛋白是位于线粒体膜上的蛋白质，能够促进线粒体氧化磷酸化解偶联反应，导致线粒体合成ATP的效率降低，以热能形式对体内能量进行释放，对线粒体的能力储备具有调节作用[10]。UCP2是解耦联蛋白的一种，在线粒体内膜上起到质子通道的作用，在正常的肝组织中，UCP2只存在于库普夫细胞进行表达，在肝细胞中的表达水平很低甚至直接不进行表达。当肝组织受到肥胖、多脂多糖刺激、内毒素、游离脂肪酸、活性氧、胰岛素、脂质过氧化物、瘦素等因子诱导时，会出现UCP2在肝细胞中的表达，产生适应性反应，表达增强，降低肝细胞氧化物产生ATP的效率，阻止脂质物质在肝组织进行沉积，预防脂肪肝形成，利于肥胖型脂肪肝患者对肝细胞的能力需求进行平衡[11]。此外，UCP2还具有其他多种作用：调节脂肪酸的β氧化，促进脂肪酸在肝组织内的跨膜运转，促进线粒体氧化利用脂肪酸，减少脂质沉积；介导质子的跨膜内流，降低线粒体内膜的电化学梯度，降低线粒体合成ATP的能力；线粒体能量分解增加，储备降低，导致肝组织细胞易坏死，肝细胞被脂肪化性变时产生的底物为UCP2的产生提供更多易于被氧化的LPO和ROS等，UCP2表达进一步增强，导致肝组织出现细胞坏死。在脂肪肝的形成过程中，UCP2表达的动态变化是一把双刃剑，它一方面是肝组织做出的适应性反应，降低脂质在肝组织的沉积；另一方面，由于脂质过度分解，能量储备降低，使得肝细胞的耐受性降低，受到缺血再灌注、禁食或果糖应激注射等二次刺激时容易出现肝细胞坏死，对脂肪肝炎和肝纤维化的抵抗能力进一步降低[12]。

本组采用大鼠建立脂肪肝模型，发现高脂饮食喂养组大鼠在脂肪肝形成过程中，体内UCP2阳性细胞的表达强度和血清中TG、FAA、ALT等含量均随着脂肪肝形成过程升高，在8～12周表现最为显著。非酒精性脂肪肝在形成过程中，脂肪肝程度不断发展，导致对肝细胞和肝功能造成损伤，脂质组织的过氧化反应不断增强，UCP2的活性表达也明显增强，与脂肪肝所引起的肝组织损伤程度密切相关。

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（收稿日期：2013-07-04）