清开灵注射液护肝药效限值测定法的建立

[摘要] 目的 研究清开灵注射液在小鼠四氯化碳（CCl4）急性肝损伤模型的保护作用，探讨其护肝药效测定的限值法。 方法 小鼠腹腔注射清开灵注射液进行预处理后口服灌胃给予0.5%CCl4，检测血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性，确认肝保护作用的限值剂量。以20 mL/kg作为限值剂量对2个厂家共4个批次的清开灵注射液的药效进行比较。 结果 阴性对照组的ALT活性为（30.70±9.93）U/L，AST活性为（68.90±13.54）U/L，小鼠给予CCl4后，ALT活性为（761.60±80.80）U/L，AST活性为（1442.70±546.62）U/L，均高于对照组（P < 0.01）；4个批次的清开灵注射液组的ALT活性分别为（378.00±29.47）、（287.80±107.74）、（289.70±26.84）、（312.10±76.22）U/L，AST活性分别为（524.30±241.09）、（400.40±253.71）、（513.80±211.89）和（548.60±263.61）U/L，均显著低于CCl4组（P < 0.01）。 结论 20 mL/kg可考虑作为限值剂量在CCl4致小鼠急性肝损伤模型对清开灵注射液护肝作用进行药效的限值法测定。

[关键词] 清开灵注射液；限值测定法；四氯化碳；急性肝损伤

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（c）-0098-03

清开灵注射液常用于中风患者的治疗，同时也对急性肝炎有显著的疗效[1]。文献报道清开灵注射液能降低四氯化碳（CCl4）导致的大鼠血氨升高并恢复肝功能[2]，能够有效地防治酒精对大鼠产生的肝损伤[3]等。但目前少见对其肝保护作用的研究。CCl4致肝损伤模型是一个经典的肝损伤模型，重复性好且实验成本低廉[4-5]。本研究参考关于中药生物活性测定的建议[6]，利用CCl4诱导的小鼠肝损伤模型，以血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）为指标，尝试建立一个基于清开灵注射液肝保护作用的药效限值测定法。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

T厂3批清开灵注射液（批号：101032、100917和100927）。S厂2批清开灵注射液（批号：10100903、10104705）。5批清开灵注射液经检验均符合《中国药典》2010年版规定。联苯双酯滴丸（广州星群（药业）股份有限公司，批号：IF40059）。CCl4（江苏强盛化工有限公司，批号：20080830）。ALT、AST试剂盒（日本和光纯药工业株式会社，批号分别为TM612、TM610）。

1.2 仪器

日立7020全自动生化测定仪；岛津UX4200S电子天平；SARTORIUS BP211D电子天平；Eppendorf 离心机。

1.3 实验动物

SPF级雄性NIH小鼠，体重25～30 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（粤）2008-0002。

1.4 实验方法

1.4.1 限值剂量的筛选[5] 取30只小鼠，随机分为阴性对照组，CCl4组、清开灵注射液组（批号：101032），每组10只。清开灵注射液组给药剂量为20 mL/kg，约为临床用量的30倍。清开灵注射液组每天腹腔注射清开灵注射液原液，给药体积为20 mL/kg。阴性对照组和CCl4组腹腔注射等量生理盐水。

1.4.2 量效关系实验 取60只小鼠，随机分为阴性对照组，CCl4组，联苯双酯组，清开灵注射液（批号：101032）低、中和高剂量组，每组10只。低、中和高剂量组每天分别腹腔注射5、10、20 mL/kg清开灵注射液。阳性对照组经口给予联苯双酯，剂量为200 mg/kg，清开灵注射液组和联苯双酯组给药体积均为20 mL/kg，临用前以生理盐水配好待用。阴性对照组和CCl4组腹腔注射等量生理盐水。

1.4.3 剂量限值确证实验 取70只小鼠，随机分为阴性对照组、CCl4组、联苯双酯组（200 mg/kg）、T厂清开灵注射液组（批号：100917）、T厂清开灵注射液组（批号：100927）、S厂清开灵注射液组（批号：10100903）以及S厂清开灵注射液组（批号：10104705），每组10只。清开灵注射液组给药剂量均为20 mL/kg。阴性对照组和CCl4组腹腔注射等量氯化钠注射液。

1.4.4 给药时间和方法 各组连续给样3 d，第3天各组给样1 h后，CCl4组、联苯双酯组和清开灵注射液组经口给予0.5%CCl4花生油溶液，给样体积为25 mL/kg。阴性对照组给予等量的花生油。CCl4灌胃24 h后各组再给对应的样品一次，48 h后小鼠进行摘眼球取血，离心取上清测定ALT和AST含量。取血前16 h，各组小鼠禁食，仅提供饮用水。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 限值剂量筛选结果

阴性对照组的ALT含量为（39.80±11.37）U/L，AST含量为（104.0±16.46）U/L。当小鼠给予CCl4后，ALT含量为（853.00±112.63）U/L，AST含量为（1368.70±229.40）U/L，显著高于对照组（P < 0.01）。清开灵注射液组的ALT含量为（470.40±46.57）U/L，AST含量为（719.70±162.43）U/L，均低于CCl4组（P < 0.01）。结果见表1。

2.2 量效关系实验结果

阴性对照组的ALT含量为（55.80±21.97）U/L，AST含量为（117.30±32.51）U/L。当给予小鼠CCl4后，ALT含量为（761.00±202.09）U/L，AST含量为（1285.30±402.44）U/L，均高于对照组（P < 0.01）。联苯双酯组的ALT含量为（259.00±102.82）U/L，AST含量为（635.40±207.99）U/L，显著低于CCl4组（P < 0.01）。清开灵注射液低、中和高剂量组的ALT含量分别为（675.00±220.04）、（495.80±106.47）、（368.70±70.68）U/L，AST含量分别为（1118.30±345.80）、（810.70±325.07）、（582.50±217.55）U/L，除低剂量组外，中和高剂量组的ALT和AST含量均显著低于CCl4组（中剂量组P < 0.05，高剂量组P < 0.01），高剂量组（20 mL/kg）的保护作用最为明显。结果见表2。

2.3 剂量限值确证实验结果

阴性对照组的ALT活性为（30.70±9.93）U/L，AST活性为（68.90±13.54）U/L，当小鼠给予CCl4后，CCl4组的ALT活性为（761.60±80.80）U/L，AST活性为（1442.70±546.62）U/L，显著高于对照组（P < 0.01）；联苯双酯组的ALT含量为（153.50±65.13）U/L，AST含量为（445.20±208.24）U/L，显著低于CCl4组（P < 0.01）。4个批次的清开灵注射液组的ALT活性分别为（378.00±29.47）、（287.80±107.74）、（289.70±26.84）、（312.10±76.22）U/L，AST活性分别为（524.30±241.09）、（400.40±253.71）、（513.80±211.89）、（548.60±263.61）U/L，均低于CCl4组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），不同批次的清开灵注射液组间的ALT和AST无统计学差异（P > 0.05）。结果见表3。

3 讨论

清开灵注射液在临床上常用于病毒性肝炎的治疗并且疗效显著，但对其药效及其机制的研究少见报道。本实验利用CCl4致小鼠小鼠肝损伤模型，尝试对清开灵注射液的肝保护作用药效检测建立一个快速便捷的限值测定法，这将对生产企业或检测机构在生物活性方面对其进行质控具有参考意义。

CCl4致小鼠小鼠肝损伤模型是一个研究药物护肝活性的经典模型，CCl4在机体内由肝微粒体细胞色素P450代谢，生成三氯甲基自由基等[7]，而这些自由基可使肝细胞膜或亚细胞结构的膜脂质发生过氧化作用从而引起膜通透性升高，导致肝细胞大量ALT释放入血[8]，血清中ALT和AST含量是反映肝细胞受损的敏感且最常用的指标[9]。肝细胞膜的脂质过氧化是CCl4介导的肝细胞损伤的主要机制[10]，而清开灵注射液具有抗脂质过氧化损伤和抗氧化应激的作用[11-12]。因此，本研究以小鼠ALT和AST为指标，用快速便捷的全自动生化分析仪对清开灵注射液的肝保护作用进行药效研究。结果显示，清开灵注射液能够显著降低由CCl4诱导升高的ALT和AST含量，提示其对肝细胞具有保护作用。依据实验结果，以20 mL/kg作为限值剂量，选用两个厂家，每个厂家各两批的清开灵注射液进行肝保护作用的药效比较，结果显示四批清开灵注射液均能抑制CCl4致小鼠肝损伤，并且各批的保护作用相近，提示以20 mL/kg作为限值剂量进行清开灵注射液护肝作用的药效测定具有较好的重现性。

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（收稿日期：2013-07-10 本文编辑：卫 轲）[Key words] Qingkailing Injection； Limit method； Carbon tetrachloride； Acute liver injury