抗环瓜氨酸肽抗体检测与类风湿性关节炎的诊断

[关键词]类风湿性关节炎；环瓜氨酸肽；抗体检测

[中图分类号]R593 [文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2007）04（b）-011-02

类风湿性关节炎(RA)是一种常见的系统性自身免疫性疾病，全世界发病率约为 1%[1]，发病两年内即可出现不可逆性的骨关节破坏。现行的诊断标准中只有类风湿因子（rheumatois factor,RF）是实验室指标，而且缺乏特异性，不利于早期诊断和早期干预治疗。因此，临床上迫切需要能用于RA早期诊断的实验室指标。自1964年以来陆续证实抗核周因子抗体（APF）[2]、抗角蛋白抗体（AKA）[3]、抗丝集蛋白抗体（AFA）[4]以及抗Sa抗体[5]对RA具有高度特异性，可在疾病早期出现。但是，检测上述抗体的抗原物质存在异质性及制备技术难度大等多方面因素，目前还不能在实验室广泛应用。进一步研究发现，上述抗体在化学结构上具有相关性，他们识别表位的主要抗原决定簇都含有瓜氨酸，被称为瓜氨酸相关自身免疫系统[6]，并认为此系统可能在RA的发病及发展中起作用。

1 环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide,CCP）抗原

2000年国外首次报道，APF、AKA、AFA的共同抗原决定簇环瓜氨酸肽可经人工合成。Schellekens根据filaggrin的cDNA序列合成一条含瓜氨酸的环肽，用ELISA法检测发现其对RA具有很好的敏感性和特异性，并且较前述抗体的检测都具优越性，可视为RA新的血清标志物[7]，因此人们对RA的特异性自身抗体有了新的认识。

1.1 瓜氨酸肽（citrullinated peptide,CP）

瓜氨酸是人体中的稀有氨基酸，通常由精氨酸在转录后经酶修饰而生成，仅存在于包括丝集蛋白在内的少数几种蛋白中。人黏膜细胞角质颗粒中的丝集蛋白前体在细胞分化过程中被酶分解成10~12个丝集蛋白亚基，在此过程中，蛋白被去磷酸化，一些精氨酸残基在多肽精氨酸脱氢酶催化下脱氨基转化成瓜氨酸残基[7]。现有资料显示，AFA、AKA、APF均可识别上皮丝集蛋白及其前体蛋白，可能的解释是这种蛋白富含瓜氨酸残基，可被RA血清中的这些自身抗体识别。瓜氨酸残基是形成AFA、AKA、APF所识别抗原决定簇中的必要成分。上面提到的抗Sa抗原，不是丝集蛋白，但因含有瓜氨酸的波形蛋白（Vimentin），同样能被RA血清特异性地识别。据此，1998年Schellkens按丝集蛋白cDNA序列，人工合成含有瓜氨酸残基的短肽后，再经ELISA筛选出具有抗原性的片段。利用合成的瓜氨酸肽（一种直链线性肽）作为抗原基质，在RA血清中用ELISA法检测出抗瓜氨酸肽抗体（anti-citrullinated peptide antibody）,结果显示该抗体可在76%的RA中检测出，特异性为96%，并且该抗体可在RA早期出现，甚至在临床症状出现之前就可以检测到此抗体[8]。

1.2 环瓜氨酸肽

以瓜氨酸肽作为抗原来检测有一定的缺点：①在用ELISA法检测时常用到聚苯乙烯，瓜氨酸肽常常被聚苯乙烯吸收而影响检测结果，解决此问题的方法是用共价键来连接，使肽链变得更加稳定[7]。②瓜氨酸肽是一种直链线性肽，且肽链相对较短，在溶液中活动度大，没有很稳定的构象。即使有一小部分肽保持了很稳定的构象，包含了所有的抗原位点，由于这种原因，使得抗体对肽的亲和力降低。解决的方法是对这些肽做一些限制，使其具有易与抗体结合的构象。在抗原-肽复合体中，肽链经常呈现β-转角构象，而环化肽可以模仿最初抗原决定簇的β-转角构象，从而提高其对抗体的亲和力。2000年，Schellekens等[8]将一条由19个氨基酸残基组成的瓜氨酸肽中的2个丝氨酸替换为半胱氨酸，形成与β-转角具有相似结构的二硫键，合成环瓜氨酸肽。用ELISA法检测RA的抗CCP抗体，敏感性较用直链线性肽为抗原有明显提高，分别为68%和49%，两者的特异性相似,为98%和96%。目前，国外已研发出高度纯化的CCP（第二代）作为抗原物质，明显增加了与抗CCP抗体的结合力。荷兰莱顿大学医学中心Gaalen等的一项研究显示，第二代抗环瓜氨酸肽（CCP2）自身抗体诊断类风湿关节炎（RA）的准确性以及对该病预后的判断都优于第一代抗环瓜氨酸肽（CCP1）自身抗体[9]。

2 抗CCP抗体

抗CCP抗体主要为Ig类抗体，对RA的特异性达98.98%。在RA的很早期阶段就可出现阳性，且具有很高的阳性预测值，可达98.21%；抗CCP抗体阳性的患者更容易发展成通过放射学方法检测到的关节损害。抗CCP抗体与RF具有相同的敏感性，但特异性更高。

2.1 产生抗CCP抗体的细胞

2001年，国外学者[10]研究了RA患者B淋巴细胞分泌抗CCP抗体的情况，发现RA患者和健康对照组的外周血B淋巴细胞都可以在有外界刺激物的条件下，如与L-CD40L细胞和IL-10或CD-3激活T细胞共同培养，则可产生抗CCP抗体，但在缺乏上述刺激物的情况下外周血B细胞不产生抗CCP抗体，说明外周血B细胞不能自发地产生抗CCP抗体；同时研究发现RA组外周血B细胞产生抗CCP抗体的能力和浓度比健康对照组要高。该学者又研究了RA患者滑膜和骨髓中B细胞分泌抗CCP抗体的情况，发现两者的B细胞可自发地分泌抗CCP抗体，但这种情况仅在抗CCP抗体阳性的RA患者中出现。我国学者曾小峰检测7例RA病人的关节液，发现滑液中也能检测到抗CCP抗体[11]。

2.2 抗CCP抗体的检测

自2000年Schellkens建立CCP抗体ELISA法诊断RA以来，现已有商品试剂供应。Schellekens首次用ELISA在RA患者中检测到抗CCP抗体，敏感性和特异性分别为68%、98%[7]。2001年国内学者建立ELISA法检测RA患者的抗CCP抗体，敏感性和特异性分别为46.6%和96.6%[11]。临床资料显示，抗CCP抗体对RA具有很高的特异性（98%）和敏感性（68%~75%），即使是RA早期患者，敏感度也可达40%~60%[8]。最近国内两位学者利用德国欧蒙公司研制的试剂盒诊断RA，其敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为84.57%、94.74%、95.48%、82.35%[12]和88.68%、96.63%、94.00%、93.48%[13]，各项评价指标都很好。ELISA法简便、标准、结果可靠，可以解决AKA、APF间接免疫荧光法存在的结果定量和检测的标准化等问题。这种合成肽CCP是一种很理想的抗原底物，且可以大量人工合成，并保证有很高的纯度，其肽链相对较短，不易与其他血清成分产生特殊的相互反应，故可以在临床上推广应用。

3 抗CCP抗体的临床应用

3.1 抗CCP抗体可用于RA早期诊断及早期鉴别诊断

Bizzaro等[14]发现抗CCP抗体与早期RA强相关（P=0.004），但与年龄、性别无相关性。Schellekens等[7]研究了数百例有早期关节症状的患者，随访1年后在486人中发现149人（31%）为早期RA，检测抗CCP抗体特异性达96%，阳性预测值为84%。SLE和RA在早期有时都会出现小关节侵蚀性病变，为了区别两者，Mediwake[15]研究了抗CCP抗体、RF、抗RA33抗体的作用，结果发现抗CCP抗体在区别早期RA和早期侵蚀性小关节病变的SLE时有很重要的价值。有资料显示，检测16例关节炎患者血清抗CCP抗体有1例阳性，8例SLE患者血清全部阴性 [14] 。Avcin T等[16]检测了109名JIA（幼年型特发性关节炎）患者，仅有2例抗CCP抗体阳性，占2%，而30名成人RA对照组中19名抗CCP抗体阳性（36%），说明抗CCP抗体在JIA中可以检测到，但阳性率较成人RA低得多，对2例抗CCP抗体阳性患者随访后发现抗CCP抗体转阴。

3.2 抗CCP抗体对RA预后的价值

Schellekens研究发现抗CCP抗体阳性是侵蚀性关节损害的一个重要标志及危险因素，并指出检测抗CCP抗体与联合检测抗CCP抗体与RF相比较，对预测2年后侵蚀性关节损害无显著性差异[7]。Kroot EJJA等[17]经过对数百例发病1年以内的RA患者进行1~6年的随访，发现抗CCP抗体可以在RA早期出现，并通过对DAS、HAQ以及影像学评分的连续观察，抗CCP抗体阳性的RA患者骨破坏较阴性者严重。Gaalen[9]的研究显示，抗CCP2抗体是预测关节损害进展的最重要指标，显然优于抗CCP1抗体。

3.3 国内外研究进展及应用前景

目前，针对RA的临床和基础研究仍然是风湿病中的热点领域之一，最主要的进展包括蛋白质瓜氨酸化和调节性T细胞（Treg）在RA中作用的研究以及多种生物制剂在RA的应用等。不同的瓜氨酸化蛋白及其抗体检测是2005年有关RA诊断的主要研究领域之一。许多研究表明，瓜氨酸化纤维蛋白原、Ⅱ型胶原和波形蛋白等在多种关节炎组织中均有表达，但抗瓜氨酸化蛋白的抗体只见于RA患者，而在其他关节炎患者中很少阳性，说明抗瓜氨酸化蛋白抗体在RA具有特异性，并可能与本病的发病及病变进展有关。国外学者Burmester、Lakos和Klotz等对抗瓜氨酸化波形蛋白抗体（MCV）的研究结果，都显示了MCV在诊断RA中有很高的敏感性和特异性；Cruyssen等研究发现，抗瓜氨酸化人纤维蛋白原抗体（AhFibA）与抗CCP2抗体在诊断早期RA中有相似的诊断价值。迄今为止，已有大量研究提示，抗环瓜氨酸抗体、抗瓜氨酸化Ⅱ型胶原蛋白抗体及纤维蛋白原抗体在RA诊断和预后评估中具有重要作用。

综上所述，抗CCP抗体对RA的诊断具有很高的敏感性和特异性，并可应用于RA的早期诊断、鉴别诊断及预后评估。由于采用ELISA法检测，克服了AKA、APF间接免疫荧光等方法的不足；CCP可以人工合成大量高纯度成品，以满足各种实验要求。因此，抗CCP抗体是目前所知最有希望广泛应用于RA早期诊断的一种自身抗体。今后的研究重点在于明确抗CCP抗体与RA发病机制、病情活动、治疗监测及预后评价的关系等。

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