旱稻65及其杂交后代的RAPD分析

摘要：利用随机扩增多态性DNA标记（RAPD）从分子水平检测旱稻65（Oryza.sativa L. cv. upland rice 65）及杂交后代间的遗传差异。采用20对随机引物对两者基因组DNA进行RAPD-PCR扩增。结果表明，RAPD共扩增出159个位点，其中多态性位点有33个，占总位点的20.75%。旱稻65和杂交后代之间存在RAPD多态性，表明旱稻65和杂交后代之间DNA水平存在差异。

关键词：旱稻65（Oryza.sativa L. cv. upland rice 65）；杂交后代；随机扩增多态性DNA标记（RAPD）；聚合酶链式反应式（PCR）

中图分类号：S511.3+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4519-03

随机扩增多态性DNA标记（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术是建立在PCR（Polymerase chain reaction）基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术，广泛应用于大豆（Glycine max）[1]、玉米（Zea mays）[2]、番茄（Solanum lycopersicum）[3]等生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。RAPD在旱稻研究中具有广泛的应用，旱稻的种质资源鉴定、遗传多样性、遗传改良研究等都与RAPD标记有关[4，5]。

旱稻是通过人工选择培育而来可适应无水层土壤条件的生态型稻，具有耐旱性强、需水量少等特点，是进行作物抗旱遗传改良的宝贵种质资源，是推行节水农业、旱作农业的最佳旱粮作物之一[6]。加强旱稻种质资源保护，挖掘抗旱基因资源，加快传统旱稻品种的遗传改良，对缓解当前水资源短缺具有重要意义。赵凤梧等[7]通过将高光效、高抗性的C4植物稗草作为父本与旱稻65进行两属杂交，后代F5与高粱进行三属杂交，得到稳定遗传的后代。杂交后代光合效率及抗逆性状均有明显提高，并从同工酶及AFLP水平对试验材料进行了研究，证实了后代中确有优良性状基因的存在[8，9]。本研究选用旱稻65及旱稻/稗草//高粱的三系杂交后代（以下简称杂交后代）为材料，通过20对随机引物分别对其基因组DNA进行RAPD分析，为旱稻种质鉴定及新品种选育等方面提供一定的分子生物学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

旱稻65及杂交后代种子由河北省农科院旱作农业研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 植物组织材料的培养 选取饱满度一致的旱稻65及杂交后代种子各50多粒，0.1%氯化汞消毒10 min，蒸馏水冲洗5次，放于铺有3层滤纸的培养皿中浸种发芽，待长至1周后选取幼嫩叶片进行基因组DNA提取。

1.2.2 基因组DNA的提取 旱稻65及杂交后代基因组DNA提取采用CTAB法[10]提取。

1.2.3 RAPD-PCR扩增 RAPD引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的随机引物S1-S20。20 μL反应体系包括：10×PCR Buffer 2 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 μL， RAPD引物2 μL， DNA（30 ng）4 μL， Taq DNA聚合酶（5 U/mL）1 μL，ddH2O补足至20 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，45个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。RAPD产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳， 溴化乙锭染色，紫外凝胶成像仪扫描观察。

2 结果与分析

2.1 旱稻65及杂交后代基因组DNA检测

通过琼脂糖凝胶电泳对旱稻65及杂交后代基因组DNA进行检测（图1），所提取的基因组DNA条带较清晰，很少有降解，符合RAPD扩增要求，可用于PCR分析。

2.2 旱稻65及杂交后代的RAPD分析结果

通过20对随机引物对旱稻65及杂交后代进行RAPD分析（图2、图3）。由图2、图3可以看出，除了引物S2引物对杂交后代（S2-Z）未扩增出条带，其余19对引物均对两个品种扩增出不同长度的条带，并且扩增片段大都分布在0.1～2.0 kb之间。同时在扩增的条带中，除了S4、S7、S12、S17和S20引物对两个品种的扩增条带没有明显区别外，其余15对引物均可扩增出长度或亮度不一的特异条带。

2.3 旱稻65及杂交后代的多态性位点

多态性的引物RAPD扩增共得到159条带，其中多态性条带33条，多态性程度为20.75%。每个引物可扩增出1～5条多态性条带，平均多态性条带为1.56。此外，不同随机引物对旱稻65及杂交后代的扩增条带有很大不同。由表1可知，引物S3、S8、S9、S10、S11，S15、S16的多态性条带只有1条，引物S14、S18的多态性条带有2条，而引物S2有5条多态性条带。有些引物虽然扩增的总带数多，但多态性条带比例较少，如引物S4和S7基本没有多态性条带出现。有些引物虽扩增出的总带数少，但多态性条带比例较多，如引物S2扩增的总条带数为5，但是多态性条带比例可达100%。有些引物扩增出的总带数和多态性条带比例均较低，如引物S16扩增出的总带数为5，多态性条带比例只有20%。

3 小结与讨论

利用RAPD技术对旱稻65及杂交后代进行分析发现，除了引物S2对杂交后代未扩增出任何条带外，其他引物均可扩增出大小不一的特异条带。从总的扩增水平来看，旱稻65及杂交后代呈现不同的扩增多态性，但两者整体多态性偏低，多态性程度仅为20.75%。杂交后代是以旱稻65为母本进行多次杂交而产生，因此在基因组水平上可能存在很大的一致性，这也是导致两者多态性偏低的重要原因。但从对两者生理水平的研究发现，杂交后代在多个参数中均优于旱稻65。经过多次杂交后，虽然两者在基因组水平上差异有限，却可导致杂交后代生理上的优越性，表明通过杂交可以将稗草和高粱中的优良基因导入旱稻65中，最终产生了具有较好抗逆性的杂交后代。因此，可以将稳定的差异条带进行克隆、鉴定及分析，筛选较好的抗逆基因，为转基因研究奠定基础。

同时发现，在统计多态性条带时不能只以条带的有无来判断，实际上很多扩增条带的强弱也可反映DNA水平的变化，同时也可作为差异来统计。由于RAPD标记是从分子水平上揭示种质间的遗传差异，比传统的遗传标记准确度要高，因此，通过结合不同的分子标记方法，为选育杂交新品种提供一定的理论依据，为更好指导现代稻作育种提供便利。

参考文献：

[1] 刘萌娟，李鸣雷，赵惠贤，等.陕西大豆资源遗传多样性及变异特点研究[J].植物遗传资源学报，2010，11（3）：326-334.

[2] 朱 英，陶 刚，黄永会，等.分子标记技术在玉米遗传育种上的应用[J].贵州农业科学，2010，38（1）：13-16.

[3] 张晓烜，许向阳，王傲雪，等.番茄种质资源遗传多样性的RAPD分析[J].北方园艺，2011（13）：115-118.

[4] 任光俊，周良强，陆贤军，等.旱稻种质的遗传差异和配合力分析[J].分子植物育种，2005，3（5）：663-675.

[5] 王 英，叶 通，邱海燕，等.49份旱稻种质RAPD标记遗传多样性分析[J].中国农学通报，2011，27（24）：21-28.

[6] 程建峰，章兴发，潘晓云，等.陆稻主要性状的产量效应及其育种应用[J].江西农业大学学报，2002，24（4）：460-463.

[7] 赵凤梧，李慧敏，马俊永，等.旱稻（Oryza sativa）/稗草（Echinochloa caudata）/高梁（Sorghum bicolor）三属杂种表现及分析[J].核农学报，2004，18（5）：335-339.

[8] 时丽冉，白丽荣，，等. 旱稻， 稗草，高粱三属杂交过氧化物酶和酯酶同工酶分析[J].邢台学院学报，2006，21（4）：117-119.

[9] 白丽荣，时丽冉. 旱稻，长芒稗，高粱属间杂交后代幼苗对干旱胁迫的生理反应特点研究[J].江苏农业科学，2008（1）：29-31.

[10] 王 英，邱海燕，高和琼，等.甘蔗基因组DNA提取方法的研究[J].中国农学通报，2008，24（12）：44-49.