有机和常规苹果园的土壤微生物结构差异研究

摘 要： 【目的】研究有机苹果园和常规苹果园的土壤微生物结构差异，为苹果园土壤改良提供理论依据。【方法】以北京市昌平区连续5 a应用有机栽培方法的10个苹果园和4个常规管理苹果园的土壤为对象，利用磷脂脂肪酸多态性（PLFA）技术和稀释平板计数法研究两种管理方式下果园土壤微生物的结构差异。【结果】结果表明，有机园和常规园的土壤微生物群落结构差异显著。常规果园土壤微生物总PLFA为114.99 nmol·g-1，是有机果园（43.44 nmol·g-1）的2.6倍，但有机果园PLFA丰富度高19%，生物多样性高。有机苹果园土壤微生物中革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的比例为1.50，常规苹果园为0.30；有机苹果园真菌生物量占2.84%，常规果园为6.55%，差异显著。二类果园可培养微生物数量差异不显著。【结论】有机苹果园和常规苹果园的土壤微生物结构存在显著差异，常规苹果园农药及化肥的使用降低了微生物群落的丰富度和功能多样性。

关键词： 有机苹果园； 常规管理果园； 土壤微生物； 群落结构； 磷脂脂肪酸分析

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980

中国是世界第一大苹果生产国和消费国，2010年我国的苹果栽培面积和产量分别占世界的51%和48%[1]；长期以来，苹果生产始终遵守“上山下滩，不与粮棉争田”的原则，土壤瘠薄、有机质含量低、化肥用量大等导致的土壤酸化、养分不平衡、土壤质量退化问题，直接影响到苹果树体生长、产量增加和品质提高。果树有机栽培在世界发达国家发展较快，而我国才刚刚起步，北京市近几年来大力推广以土壤改良、增肥地力为基础的果树有机栽培技术，土壤质量和果实品质有了较大的提高。土壤微生物是土壤重要有机组成部分，并参与土壤中养分的固定、分解、循环与转化等过程[2]，并且可以与作物的根系发生互作[3]，直接影响土壤的有效肥力和作物生长。植物种类[4]和耕作方式会对土壤微生物群落结构产生稳定的影响，果树栽培耕种周期长，对土壤微生物群落结构影响显著[5]。研究苹果园有机和传统土壤管理方式下土壤微生物群落结构差异及对土壤微生物的影响，对苹果园土壤改良、培肥地力和保持苹果树可持续生产具有重要的意义。从20世纪90年代中期开始，大量国内外的研究表明土壤中微生物群落结构是反映土壤肥力和健康状况的重要指标[6-8]。Pennanen等[9]基于PLFA检测提出了真菌比例降低、细菌比例上升通常与土壤肥力呈正相关。Mazzola等[10]发现小麦等禾本科植物的生长提高了恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的生物量，降低了荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的生物量，从而抑制土壤中植物病原真菌含量、预防和减轻苹果重茬病。果树生长周期长，受土壤微生物的影响更为显著[11- 12]。近年来部分国内学者开展了相关工作，李会科等[13]报道了田间生草可以提高果园土壤中三大类菌（细菌、放线菌、真菌）的类群数量，显著提高土壤过氧化氢酶、尿酶、碱性磷酸酶活性，改良土壤品质；李丙智等[14]对短枝富士苹果园土壤进行沼液配施钾肥处理，土壤容重比和孔隙度等物理性状得到改善，三大类菌数量提高，果实品质有所提高；李智卫等[15]研究了不同树龄的苹果园土壤微生物特征，提出老龄果园真菌比例提高，微生物多样性降低的问题；张强等[16]对北京周边不同产量苹果园、梨园、桃园、葡萄园的土壤微生物群落研究，发现不同果园土壤微生物总量和构成差异显著。本研究通过连续5 a应用有机栽培方法进行增施有机的土壤改良和培肥力后的10个苹果园和4个常规管理苹果园的土壤调查，应用PLFA技术和稀释平板法分析二类苹果园土壤微生物群落结构，准确反映微生物群落的整体状况，探讨有机和常规苹果园土壤微生物群落结构差异特点，为苹果园土壤改良、培肥地力提供科学的参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

2009年10月，于北京市昌平区（东经116°，北纬40°），选择土壤质地均为壤土，树龄15～20 a生，株行距为3 m×5 m，主栽品种为宫藤富士（Malus domestica Borkh ‘Red Fuji’），砧木为八楞海棠（M. micromalus Makino），王林为授粉品种，产量基本稳定在30 000～45 000 kg·hm-2，连续5 a应用有机栽培方法的苹果园10个、常规管理的苹果园4个，每个果园面积0.6 hm2以上；有机果园的土壤管理是不施用任何化学肥料，每年秋季或春季增施30 000～45 000 kg·hm-2腐熟有机肥，常规管理果园每年秋季或春季增施15 000～30 000 kg· hm-2农家肥，并按照常规方法施用化学肥料。苹果果园主要营养状况见表1。

1.2 样品采集及分析

在每个果园随机选取3个取样区，每个取样区在树冠垂直投影以内30 cm处，以土钻采集0～40 cm层次的土壤，混匀后分别进行土壤理化性质测定、PLFA检测、微生物稀释平板涂布计数法检测。

1.2.1 土壤理化性质测定 烘干法测定土壤含水量，高温外加热重铬酸钾氧化容量法测定土壤有机质，凯氏定氮法测定土壤全氮，H2SO4-H2O2消解-钒钼黄比色法测定土壤全磷，碱解扩散法测定碱解氮，碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定速效磷，乙酸铵浸提-火焰光度计法测定速效钾，醋酸钠浸提-原子吸收法分析有效钙，DTPA浸提-原子吸收分光光度法分析有效铁，氢氟酸-高氯酸-硝酸消煮-原子吸收光谱法测定全铬，pH计测定土壤pH。

1.2.2 土壤磷脂脂肪酸测定 PLFA的提取、分离和甲脂化参考Frostegard等[17]的方法。PLFA分析用GC-MS联用仪分析（Agilent HP6890，安捷伦公司，美国），毛细管为HP-5ms （规格60 m × 0.32 mm，惠普公司，美国），以磷脂脂肪酸19∶0作为内参。以高纯氦气作载气，不分流进样。进样口温度230 ℃，检测器温度270 ℃。初始温度80 ℃保持1 min，以20 ℃·min-1的速率升到160 ℃，以5 ℃·min-1的速率达到温度270 ℃。

1.2.3 土壤微生物的稀释平板计数法 称取干重为10 g的新鲜土壤样品，以无菌水配成菌悬液，十倍稀释法进行稀释并涂板培养。细菌、放线菌、真菌分别选用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养细菌、重铬酸钾改良高氏琼脂培养基培养放线菌和链霉素-马丁氏孟加拉红琼脂培养基，分别对土壤细菌、放线菌和真菌进行菌落计数[16]。

1.3 数据处理

试验数据以统计学软件SPSS 19，CANOCO 4.5，Microsoft Excel 2007分析。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

统计了10个有机苹果园和4个常规管理果园的土壤理化性质，以SPSS软件进行T检验比较，统计结果见表1。有机苹果园和常规苹果园在有机质、全氮、全氮、全磷、碱解氮、有效磷、有效钾、有效钙和有效铁含量以及酸碱度差异不显著。

2.2 土壤微生物群落差异分析

2.2.1 PLFA差异的主成分分析 对有机苹果园和常规管理苹果园的土壤微生物磷脂脂肪酸结构进行主成分分析可以发现土壤微生物分为2个类群，有机果园和常规果园差别显著，2种生产管理方式下土壤微生物群落的差异显著且高于同种生产方式的内部差异。

2.2.2 PLFA生物指示因子统计 如表2所示，施用化肥的常规果园与有机果园的各项生物指示因子差异显著（P﹤0.01）。相比于有机果园，施用化肥可以大幅提高土壤微生物PLFA的总量，但同时微生物的多样性下降19%，种群多样性遭到破坏。常规管理果园中革兰氏阴性菌为主体，而有机果园中革兰氏阳性菌为细菌主要类群，有机果园土壤微生物中革兰氏阳性菌和阴性菌的比例为1.5∶1，是常规果园的5倍。常规果园土壤中真菌比重是有机果园的2.1倍。

2.3 可培养土壤微生物计数

有机苹果园土壤可培养细菌、放线菌、真菌数量均值低于常规苹果园，但是以SPSS进行T检验结果为2者差异不显著。

3 讨 论

随着公众对食品卫生安全的关注度不断提高，苹果有机化生产得到迅速发展[18]，有机栽培比例逐渐提高，但目前对有机果园土壤状况的研究尚少。苹果树生长周期长，传统果园在30 a以上，新型果园也在15 a以上，不同生产方式对果园土壤的影响具有累积效应，而土壤的健康状况直接决定了苹果的可持续生产。本试验研究了有机苹果园和常规果园的土壤理化性质和微生物群落结构差异。二类果园在有机质、全氮、全磷、碱解氮、有效磷、有效钾、有效钙、有效铁等养分水平和土壤酸碱度等方面差异不显著，但土壤微生物群落结构有明显差别。PLFA主成分分析表明，二类果园的土壤微生物形成了不同的类群。常规果园土壤微生物总PLFA达到114.99 nmol·g-1，是有机果园的2.6倍，但是PLFA丰富度降低19%，微生物群落多样性明显下降。常规农业生产方式中农药化肥的使用会降低土壤微生物群落的多样性，Zhang等[19]对稻田的土壤微生物群落结构研究同样发现施用化肥可以将微生物总PLFA量由25 nmol·g-1提高到59 nmol·g-1，同时使土壤微生物PLFA丰富度由20.0降低到14.0；Ge等[20]研究茶园土壤微生物结构时发现施用尿素会使土壤微生物的种类多样性大幅降低。化肥和农药的使用不但提高生产成本、导致土壤板结、引起水体富营养化等环境问题，还会对土壤微生物类群多样性和群落构成造成不利影响，严重制约农业的可持续发展。

传统的果园土壤质量评价主要针对有机质、酸碱度、孔隙度等物理/化学指标，而作为土壤长期肥力的一个重要指示因子，土壤微生物群落的健康程度决定了果园的抗病害能力[21]和可持续发展能力[22]，但是缺乏对其评价的量化指标。本研究结果显示常规管理的苹果园土壤真菌比例、真菌与细菌PLFA的比值均高于有机苹果园土壤。而H？觟gberg等[23]研究发现真菌与细菌PLFA比值与土壤氮矿化能力呈负相关，说明有机苹果园土壤的微生物群落氮固定能力较高。革兰氏阳性菌与植物组织、有机质的降解能力有关[24]，是土壤健康状况的重要指示因子，而农药和杀虫剂的使用以及重金属污染都会降低革兰氏阳性菌的生物量并提高革兰氏阴性菌的生物量[25]。有机苹果园中革兰氏阳性菌为细菌主要类群，Gram+/Gram-值约为1.5且所有被测有机苹果园的比值均高于1.2；而常规苹果园中革兰氏阴性菌为主体，Gram+/Gram-值约为0.3，说明化肥和农药的使用对果园土壤微生物群落结构影响显著。在一定耕作条件下，土壤微生物群落结构具有相对的稳定性，因此Gram+/Gram-比值可以作为果园土壤质量评价指标。本实验中统计两种类型果园土壤可培养微生物的数量差异不明显。

土壤微生物群落作为一个微观生态系统，具有一定的稳定性[26]。农药和化肥的使用作为外界干预会打破其自身的稳定性，造成少数适宜种群大量繁殖，部分不适宜种群受到抑制。常规果园土壤微生物的总PLFA量高于有机果园，但是微生物种群多样性下降反映了这种影响。同时，微生物也反作用于环境因素，部分微生物对土壤物理形态的维持具有重要作用，该类群功能被抑制很可能和化肥使用后的土壤板结相关。有机果园具有更高的微生物种群多样性，从生态学的角度来讲，因为其物种丰富，对环境的适应能力较强，稳定性较强，更具有可持续发展的潜力。同时正是自然环境土壤的生态复杂性导致可培养微生物只占小部分，同时平板计数法无法分辨类群内部的种群分布，因此在两类果园土壤中差异并不显著。

4 结 论

有机苹果园土壤微生物群落比常规管理果园组成复杂，更符合可持续发展的要求。土壤微生物的Gram+/Gram-比值和真菌PLFA百分数可以作为果园土壤质量监控的重要参数。微生物中具体种属的分布与土壤生产能力的关系需要深入研究。

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