色谱法在名贵中药材分析与鉴别的应用

【摘 要】：本文通过检索本领域国内外相关资料文献并经过深入分析整理和归纳，总结了薄层色谱法(TLC)､气相色谱法(GC)､纸色谱､高效液相色谱(HPLC)､高效毛细管电泳(HPCE)､和凝胶电泳等色谱分析法，并系统的介绍了色普法自创立以来在中药材鉴别中的应用情况。因此，本文为色谱法在中药材鉴别中的进一步研究提供了全面的研究综述。

【关键词】：中药材 色谱法

【中图分类号】R45;R96【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2008)4-0044-04

我国中药材品种繁多､资源丰富药用动植物达1万余种，在当今世界“回归自然”思潮影响下，寻找天然药物的呼声日渐高涨，因而对于我国这样的中药材大国首要任务是建立一套切实可行的鉴别方法和质量保障体系。很多中药材形态相似，加工处理后形态结构易发生改变，目前采用的经典植物鉴定，性状鉴定和显微鉴定等研究方法由于鉴定标识建立在个体形态和客观观测水平上，因而存在主观性强､重现性和稳定性差等不足[1]。而分子标记技术又存在方法不够完善，资料不丰富，成本偏高无法推广到生产第一线的缺点[2]。相比之下，色普法已成为中药材鉴定中不可缺少的常规而有效的方法，尤其是对成分复杂的中药材有分离分析鉴定的双重优势。随着化学分析色谱技术的成熟和广泛应用，20世纪70年代，人们将中药中的化学成分展开于由各种不同载体制成的薄层板､纸片､胶片等物体上，不同的生药成分显现出不形状，颜色的斑点或条纹等，人们可根据斑点或条纹的位置(Rf值)､颜色､数目等特征来鉴别生药真伪和质量，从而创立了色谱法。目前常用的色谱法有薄层色谱法､气相色谱法､纸色谱法､高效液相色谱法､毛细管电泳和凝胶电泳等。

1 薄层色谱法(TLC)

薄层色谱(TLC)由于操作简单､直观､经济､适用范围广阔，在中药鉴别中应用频率最高。目前，常用的薄层色谱法有高效薄层层析法､薄层扫描法和反相薄层色谱法等[3]。

1.高效薄层层析法(HPTLC)：HPTLC的薄板采用更加细致均匀的吸附剂用喷雾法制成，提高了分离效果，增强了重现性。张虹将榧属植物叶的提取物经TLC法初步分离，再用HPTLC法测定紫杉酸的含量，具有良好的回收率，可用于定量检测[4];米莉莉等用高效薄层色谱扫描法对天然虫草与人工虫草菌丝体中核苷类有效成分进行含量测定，同时建立了不同虫草样品的荧光淬灭薄层色谱图谱[5];伍庆等用HPTLC法建立了快速测定知母药材中菝琪皂苷元的方法[6];曾长青等用高效硅胶薄层板对动物药不同蛇胆胆汁酸的14种组分进行测定，发现有相似组成[7]。

1.薄层扫描法(TLCS)：应用薄层扫描仪将薄层板转换成薄层图谱的方法叫做薄层扫描法(TLCS)[8]。TLCS所得到的图谱比目测的层析图谱更为客观准确。张尊听等以高效薄层色谱扫描法测定野葛根中游离葛根素和总葛根素含量[9];苏淑分等使用薄层扫描法测定不同品种和产地化甘草并建立了指纹图谱，可以快速的对药材品质作出评判[10];颜玉贞等完成了黄连的指纹图谱研究[11];苏微微等完成了黄参的薄层扫描指纹图谱[12]。

1.3 反相薄层色谱(RPTLC)：当薄层色谱中流动相的极性大于固定相极性时，就形成了反相薄层色谱(RPTLC)，RPTLC主要用于极性成分复杂的药材样品。张子忠等对不同产地不同时间采收的蔓荆2种》荆素和对羟基苯甲酸进行了RPTLC定量分析比较考察了多种因素对结果的影响，同时优化了实验条件，用于蔓荆子中上述两种成分分析前者回收率93.9%，后者回收率91.2%[13]。

2 气相色谱法(GC)

气相色谱法(GC)以气体为流动相，适合于挥发性成分或通过衍生化后能汽化的成分的定性定量分析，有灵敏度高､操作简便､样品无须化学前处理､提供信息量大等优点。目前使用频率较高的有裂解气相色谱(适用于不挥发成分)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)等。

2.裂解气相色谱：该发将样品放入裂解器内，在一定条件下加热样品使其瞬间裂解，生成可挥发的小分子，立即被载气带入气相色谱系统分析拄上，分离后得到裂解气相色谱图。袁敏等用此法比较了不同产地连翅的气相色谱图，13种样品的色谱图近似，重叠率达89%以上[14]。

2.气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)：将气相色谱与质谱联合使用的一项技术即为GC-MS。徐勤等GC-MS对前胡中的白花前胡丙素，丁素和紫花前胡苷的含量进行研究，发现前胡两种标准药材的图谱差异显著，证实了药典前胡的2个品种化学成分不同的说法[15];魏刚等采用GC-MS法对不同产地广藿香､组织培养广藿香､超临界提取广藿香､广藿香对照品共21品种进行了组分分析，发现石牌藿香与高要海南藿香相比，11个成分相对含量均有显著差异，而高要与海南藿香无明显差异[16];徐春艳等用此法测定出黄连与肉桂配伍后桂皮醛含量下降，下降程度与黄连比例有关[17];梁永枢等在水蒸气蒸馏法提取的挥发油中，用GC-MS对其成分进行分析，分离出20个组分，鉴定出其中的6种组分，并首次从沉香挥发油中分析得到Guaiol和α-Copaen-11-ol[18]。

3 纸色谱

纸色谱(纸上层析)属于分配色谱的一种。主要用于多功能团或高极性化合物如糖､氨基酸等水溶性成分的分析分离。目前在中药材中应用较少。

4 高效液相色谱法(HPLC)

HPLC和其他分离方法相比有柱效高､灵敏度高､分离迅速性和重复性好等特点，若配以不同的检测器，可对多种药物成分进行分析，一般用于含量测定，也可根据特征色谱峰进行定性分析[19～20]。曾宪仪等用HPLC法测定枳壳､枳实中辛弗林和N-甲基酪胺的含量，结果发现枳实中辛弗林和N-甲基酪胺的含量高于枳壳[21];曹爱民等用HPLC法测定出了决明子中大黄酚含量，含量测定结果线性关系良好，平均回收率99%[22];杨国红采用HPLC法对中成药两个制剂中桂皮醛进行测量，样品量在0～0.15范围内呈线性关系，表明本法适用于对含桂皮醛成分的中成药进行质量控制[23];另有文献建立连翘､红花､刺五加等的HPLC指纹图谱，以鉴别区分不同来源､不同产地中药材[24～25]。HPLC与现代检测器相结合又产生了一些新技术：液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)，Park等用HPLC-ELSD法同时分离和测定了人参皂甙Rb､Rc､Rd､Re､Rf､Rg和Rh等[26];液相色谱-质谱(LC-MS)，Van Breemen等首次将LC-MS技术用于人参粗提取物中的人参皂甙[27];反相高效液相色谱，张丽艳等用此法测定喜树碱含量随生长月份增加而递增规律，为药材采收时间的确定提供了依据[28]。

5 高效毛细管电泳(HPCE)

HPCE是20世纪末发展起来的一种高效快速分离技术，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物[29]，有分离模式多､分离效率高､速度快和分析范围广阔的特点。王演以HPCE法对不同属群大青叶药材的理化特征进行分析，发现异地栽培的不同属群大青叶药材的化学成分和含量差异显著[30];沈阳等测定不同种类甘草药材中甘草酸的含量程良好线性关系，本法适用于甘草酸含量的测定[31];张朝晖等用高效液相色谱法测出大海马､线纹海马､刁海马､刺海马､小海马､贡氏柄颌海龙､三斑海马､粗吻海龙､海鱼､拟海龙､尖海龙和宝珈海龙12种海马海龙类药材的电泳图谱，为海马海龙类药材鉴定提供了依据[32]。等提取菟丝子种子植物蛋白用高效液相色谱法进行生药鉴定，结果表明，同属不同种菟丝子的碱溶性和酸溶性蛋白在成分和含量上均有显著差异，根据其种子植物蛋白的电泳图谱可有效鉴别菟丝子的来源[33];孙国祥等用HPCE法对射干的水提取液进行指纹图谱研究，计算出不同产地射干的CEFP的相思度(S)大于0.92，证明不同产地的射干在化学成分的分布上是十分相似的[34];王实强等采用HPCE，用外标峰面积法测定婴栗壳中可待因吗啡和婴栗碱的含量取得了满意的效果[35];丁原菊等采用高校毛细管电泳法对紫柴胡中柴胡皂甙a与d对映体进行分离和测定取得良好的结果，柴胡皂甙a与d的回收率达97.1%[36]。

6 凝胶电泳

凝胶电泳技术自20世纪80年代初传入我国，石俊英教授等率先将现代生物技术与传统的中药学科相接合，经多年潜心研究和实践，创建了“中药电泳鉴别法”新技术，并在动植物类中药材鉴别中广泛应用。目前重要的电泳鉴别多集中在蛋白质的鉴别上，蛋白质又分为贮藏蛋白和同功酶两种。

6.贮藏蛋白电泳(凝胶蛋白电泳)：不同蛋白质因存在分子大小空间结构和电荷数目上的差异，可以通过电泳得到分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)与其他分析手段相比具有分辨率高､性能稳定､凝胶孔径可调等优点，是目前常用的蛋白质分离分析手段。金跃明等用缓冲叶提取样品中蛋白质，在10%连续的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，结果鹿鞭与其主要伪品牛鞭的电泳图谱有明显区别，不同品种鹿鞭电泳图谱也有明显区别[37];赵华英等应用蛋白质电泳得出青葙子､牛膝子､鸡冠花子､皱果苋子､苋子和反枝苋子的6种种子电泳图谱，准确的鉴别出了苋科6种种子类药材[38];赵晓荣等用蛋白质电泳得出了马鹿鞭､海狗鞭､黄狗鞭和海象鞭的清晰图谱，准确的鉴别出了4种鞭类药材，还观测出黄狗鞭与马鹿鞭样品图谱极为相似，从而提出用黄狗鞭代替马鹿鞭的设想[39];李锋等用SDS-PAGE法对羚羊角山羊角､黄羊角､绵羊角和藏羚羊角急性了电泳图谱比较，发现各样品有不同的蛋白质成分，成功的区分了这5种角类药材[40]。

6.同功酶电泳研究：同功酶是指催化作用相同而分子结构不同的一组酶，它存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中。同功酶的结构差异来源于基因差异，能稳定的遗传给后代。因此可以根据同功酶分子结构差异用电泳法来分离。常由于电泳法分离的同功酶有乳酸脱氢酶同功酶､过氧化物酶同功酶和酯酶同功酶等。

6.2.乳酸脱氢酶(LDH)同功酶：20世纪50年现乳酸脱氢酶以来[41]，同功酶用于动植物的分析鉴别也紧随而至。李大均采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对巨蜥的血清､脑､肾､肝､心肌､骨骼肌和小肠的乳酸脱氢酶(LDH)同工酶进行分离和测定.结果表明，LDH同工酶具有明显的组织特异性[42];任文华等采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对刺猬(Erinaceusdealbatus)及游蛇科的黑眉锦蛇 (Elaphetaeniura)､红点锦蛇(E.rufodorsata)和赤链蛇(Dinodonrufozonatum)等在冬眠期和活动期骨骼肌､心肌､肝等的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)同工酶谱进行了分析，并用比色法测定了以上各种组织的LDH活性，结果表明：LDH同工酶的电泳图谱只有红点锦蛇的肝和骨骼肌中存在活动期和冬眠期的明显差异，在其余动物两个时期的组织中未表现出明显变化，刺猬的肝脏LDH活性在冬眠期显著地高于活动期，而其余的动物组织冬眠期LDH活性均显著低于活动期，三种蛇类组织LDH4均未见表达[43]。

6.2.过氧化物酶(POD)同工酶：在高等动植物中，过氧化物酶广泛而大量的存在着，并有较多的同工酶。李桂兰采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳对菘蓝不同器官的POD同工酶进行分析测定，发现菘蓝的POD同工酶酶谱具有一定的器官特异性和稳定性，并且同工酶变化与生物的生长发育之间具有特异性关系，可为生物生长发育的调控研究提供参考[44];于晶等用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术对不同种源黄芩过氧化物同工酶进行研究，再利用过氧化物同工酶谱带聚类分析，可为不同种源黄芩的划分提供参考[45];陈文强等采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对天麻3种变型的过氧化物酶(POD)的同工酶进行了研究结果表明，天麻3种变型的过氧化物酶的同工酶活性不同，酶谱条带数在5～7条之间，且具有特征谱带.其中乌天麻和红天麻的酶谱条带数相同，两者的酶谱条带数均多于绿天麻;绿天麻､乌天麻和红天麻的酶谱条数依次分别为5条､7条和7条;其中基本酶带有5条，Rf值分别为0.06､0.24､0.83，0.89､0.98;乌天麻与红天麻的相似度指数为0.86，说明这两个种亲缘关系近;乌天麻与绿天麻的相似度指数为0.71，反映它们之间的亲缘关系相对较远[46]。

6.2.3 酯酶同工酶：酯酶同工酶是一类水解酶，能催化分子中酯键，酯酶同工酶在动植物体内广泛分布。张丽萍等用同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳快速简便的鉴别了蒙古黄芪和膜荚黄芪种子，为蒙古黄芪种子真实性的检验提供理论依据[47]。

综上所述，色谱法在中药材分析和鉴别中的应用已达到一定水平，但仍然存在一些不足，需要我们在逐步探索中去改进，从而达到更有效､更简便的鉴别中药材的目的。

参考文献

[1]贾恩礼，黄尉初. 中药鉴定中现代分析技术的国内应用概况[J].实用医药杂志，2006，23(8)：989～990

[2]郭伟云等.DNA分子标记技术在中药材品质鉴定中的应用进展[J].新乡医学院学报，2006，23(6)

[3]顾英，冯怡.薄层色谱新技术在中药药物分析方面的应用[J].时珍国医国药，2006，17(12)：2589

[4]张虹.TLC-HPLC 法分析非属植物叶中的紫杉酸[J].第二军医大学学报，2003，25(5)：402

[5]米莉莉，张文素.冬虫夏草及人工虫草核苷类成分的TLCS研究[J].中成药，2003，25(5)：402

[6]伍庆.知母中菝琪皂甙元测定方法探讨[J].贵州师范大学学报，2002，20(4)：72

[7]曾常青.14种蛇胆胆汁酸成分的高校薄层色谱分析[J].中药材，1996，3：139

[8]于宝珠，陈立亚.薄层色谱在中药指纹图谱中的应用[J].中国药事，2005，19(10)：619～620

[9]张尊听等.太白山野葛根中异黄酮和葛根素含量随季节的变化[J].天然产物研究与开发2002，13(6

[10]崔淑芬， 蒋铁伦， 王小如薄层色谱指纹图谱在甘草GAP生产与质控的应用[J ].现代中药研究与实践， 2004 ， 18(4) ： 3

[11]颜玉贞， 林巧玲， 谢培山， 等黄连指纹图谱研究[ J ].中国中药杂志， 1993 ， 18 (6) ： 329

[12]苏薇薇.聚类分析法在黄芩鉴别分类中的应用[J ] .中国中药杂志， 199， 16 (10) ： 579

[13]张子忠，袁久荣等.蔓荆子反相薄层色谱分析的研究[J]. 药物分析杂志，1995，15(2)：13

[14]袁敏，张铭光. 不同产地连翅的气相色谱图[J]. 中草药，2003，34(1)：70

[15]徐勤.测定白花前胡忠花前胡丁素的含量[J]. 中国药学杂志，2001，36(2)：122

[16]魏刚，符红.GC-MS法对藿香的研究[J]. 中成药，2002，24(6)：407

[17]徐春艳.气相色谱法测定黄连与肉桂配伍前后桂皮醛含量变化[J]. 药物分析杂志，2001，36(2)：11～14

[18]粱永枢，刘军民.沉香药材挥发油成分的气象色谱-质朴联用分析[J]. 时珍国医国药，2006，17(12)：2518

[19]刘春丽，刘满仓.高效液相色谱法分析中药及植物药进展[J]. 分析化学，2000，28(5)：631～643

[20]龙全江，江葳葳，熊健，等. 高效液相色谱在中药研究应用中的新进展[J].甘肃中医学院学报 ， 1999，(04)

[21]曾宪仪， 陈小红， 肖呜，等. HPLC法测定枳壳､枳实中辛弗林和 N-甲基酪胺的含量[J]. 中国中药杂志 ， 1997，(06)

[22]曹爱民， 沙明， 孟淑智， 姜丽，等. 高效液相色谱法测定决明子中大黄酚的含量[J].中国中药杂志 ， 1997，(02)

[23]杨国红. 高效液相色谱法测定两种中成药中桂皮醛的含量[J]. 中国现代应用药学，1994，(05)

[24]张文婷， 何翱， 陈浩. 连翘的HPLC指纹谱研究[J]. 中国中药杂志 ， 2002，(05)

[25]周晓英， 张立新， 张良，等.红花的HPLC指纹图谱分析方法研究[J]. 中成药，2002，(05)

[26]Park MK，Park JH.Chromatogr.A，1996，736：7778

[27]Van Breenmen R B，Fong H.J Anal chem.1995，67：3985

[28]张丽艳， 杨玉琴. 反相高效液相色谱法测定喜树果实中喜树碱的含量[J]. 中国中药杂志 ， 1997，(04)

[29]时淑华; 何茶叶.高效毛细管电泳法在中药监测中的应用[J].河南科技学院学报(自科版)，2006，3(7)：36

[30]王寅.高效毛细管电泳法用于不同群居大青叶药材的鉴别[J]. 中草药，2003，31(2)：547

[31]沈阳，庄峙厦，王小如. 高效毛细管电泳法分离测定不同种类甘草药材中甘草酸的含量[J]现代中药研究与实践 ， 2004，(S1)

[32]张朝晖，范国荣，徐国钧，等.12种海马､海龙类药材高效毛细管电泳法鉴别[J]中国中药杂志 ， 1998，(05)

[33]，罗国安，王如骥，等.中药菟丝子的高效毛细管电泳法鉴别[J]药学学报 ， 1997，(07) .

[34]孙国祥， 万月生， 孙毓庆. 射干的毛细管电泳指纹图谱研究[J]. 色谱 ， 2004，(03)

[35]王实强， 首弟武. 高效毛细管电泳法测定罂粟壳中生物碱的含量[J]. 色谱 ， 1997，(05)

[36]丁原菊， 陆玮洁， 主沉浮， 高建军， 贾炯. 毛细管电泳法对柴胡中柴胡皂甙a与d对映体的分离和测定[J]. 山东大学学报(工学版) ， 2006，(05)

[37]金跃明， 李峰. 鹿鞭药材及伪品的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别研究[J]. 辽宁中医学院学报 ， 2005，(06)

[38]赵英华等. 苋科6 种种子类药材的蛋白电泳鉴别[J]. 中国中药杂志，2000，25(1)：52～53

[39]孙晓荣等.4种鞭类中药蛋白电泳鉴别[J]. 中国中药杂志，1997，32(5)：271

[40]李锋等 羚羊及伪品的凝胶电泳鉴别[J]. 中草药，2001，22(5)：454

[41]林岩香， 王建勤. 同功酶用于药用植物分类鉴别的技术原理与应用探讨[J]. 海峡药学 ， 1995，(02)

[42]李大筠. 巨蜥乳酸脱氢酶(LDH)同工酶的分离和测定[J]. 四川师范学院学报(自然科学版) ， 1996，(04)

[43]任文华; 杨光; 谷宇; 赵祥伟.刺猬和三种游蛇科动物冬眠期和活动期乳酸脱氢酶同工酶的比较[J].南京师大学报(自然科学版) ，2002，1.

[44]李桂兰. 中药菘蓝过氧化物同工酶的测定[J]. 山西中医学院学报 ， 2006，(04)

[45]于晶; 陈君等.不同种源黄芩的过氧化物同工酶研究[J] . 中药材， 2006，7(5)

[46]陈文强，邓百万，丁锐，吴三桥，李新生. 天麻3种变型过氧化物酶的同工酶研究[J]. 西北植物学报 ， 2005，(08) .

[47]张丽萍，史静. 蒙古黄芪和膜荚黄芪种子酯酶同工酶的研究[J].中国中药杂志，2006，9(8).

(收稿日期：2007.12.20)