酶联免疫斑点试验在结核性腹腔积液诊断中的应用

摘要：目的 运用联免疫斑点试验（ELISPOT）法对结核性腹腔积液进地诊断，并探讨其应用价值。方法 对62例明确诊断为结核性腹腔积液及54例恶性肿瘤性腹腔积液（对照组）分离其中单个核细胞，采用TB-ELISPOT法检测其结核菌抗原特异性T淋巴细胞反应，同时对腹腔积液TB-DNA采用荧光定量PCR法检测，并比较两种方法的特异性和灵敏度。结果 TB-ELISPOT法及TB-PCR法检测腹腔积液，其灵敏度分别为93.5%、64.5%，两种方法相比较差异有显著性统计学意义 (χ2=15.1，P0．05)。结论 TB-ELISPOT法对腹腔积液进行结核分枝杆菌检测灵敏度高、特异性好，是一种较为理想的实验室辅助诊断方法。

关键词：酶联免疫斑点试验；腹腔积液；结核；诊断腹腔积液在临床上较为常见，以往对于结核性腹腔积液的实验室检查多采用涂片找抗酸杆菌及PCR法检测结核杆菌，但这些方法灵敏度不够理想，近年来也有很多文献报道了采用ADA、CEA对鉴别结核性、癌性胸腹腔积液的应用价值，但而这些方法特异性较差，特别是40岁以上的结核性与癌性腹腔积液的鉴别较为困难[1]。

酶联免疫斑点试验（ELISPOT）是由Czerkinsky等于1983年建立的一种对于单细胞水平分泌特异性抗体的新免疫学方法，以后运用于检测分泌细胞因子的抗原特异性T淋巴细胞的数量。由于结核杆菌可以诱导T淋巴细胞产生细胞免疫反应，Lalvani等首先将ELISPOT法用于结核诊断，以往曾有关于ELISPOT法检测血液异性T淋巴细胞的报导[2]。本文对腹腔积液采用ELISPOT法检测，并探讨其在对结核性腹腔积液诊断价值。

1资料与方法

1.1一般资料2011年8月~2012年10月我院住院患者，共116例。根据实验室检查、影像学、病理结果及检临床表现确诊为结核性腹膜炎患者62例，年龄17～51岁，平均年龄33岁。对照组为54例恶性肿瘤患者，年龄25～54岁，平均34岁。临床医师腹穿采集腹腔穿刺液标本。

穿刺液用EDTA-K2进行抗凝后，取8ml穿刺液并使用Ficoll-Hypaque进行密度梯度离心分离其中的单个核细胞。分离后的单个核细胞于-80℃环境下贮存。

1.2试剂与仪器荧光定量聚合酶链反应(PCR)TB-DNA试剂购于达安基因生物公司，仪器为ABI 7300荧光定量PCR仪。Cryostar冻存液及结核杆菌TB-ELISPOT试剂盒购于北京达科为生物技术公司。

1.3对穿刺液沉淀提取物进行结核杆菌DNA PCR检测，按照试剂盒说明书进行扩增30个循环后，通过ABI 7300PCR分析仪软件分析判断，并报告TB-DNA拷贝数量，当DAN含量>103考贝/ml时为阳性。

1.4 ELISPOT法为贮存一定数量后批量检测。PCR法对送检后穿液抗凝离心后取沉淀物对单个或多个标本分次检测。TB ELISPOT检测运用ESAT-6（结核早期分泌抗原靶分子）和CFP-10(培养滤液蛋白10)两种抗原刺激，本试验在已包被抗体的孔中直接刺激细胞采用直接ELISPOT法，以PHA为阳性对照刺激物，每孔加样100 ul，加入的单个核细胞经重悬液浓度为2～5×106/100ul, 按试剂盒说明进行其具体操作，检测结果亦依据试剂盒说明的标准判读。

1.5统计方法使用SPSS 12.0统计软件，运用χ2检验对两种方法的检测结果的特异性及灵敏度进行分析比较，以P

2结果

采用ELISPOT法对62例结核患者的穿刺液检出阳性58例，采用PCR法检出阳性40例，两种方法的灵敏度比较P

对54例作为阴性对照恶性肿瘤患者的穿刺液分别采用ELISPOT法及PCR法，两者特异性分别为94.4%和85.2%，两种方法的特异性比较P>0.05，差异无统计学意义，见表2。

3讨论

本文通过对腹腔穿刺液选取TB-PCR法及ELISPOT法进行检测并比较。TB-EIISPOT法使用重组CFP-10和ESAT-6，这两种蛋白具有和天然蛋白相同抗原性,可使结核杆菌再感染的记忆性效应T淋巴细胞增殖并产生大量INF-γ。本文所采用的ELISPOT法利用结核杆菌感染者腹腔积液中存在结核菌特异的活化T细胞，培养液中加入ESAT-6和CFP-10为结核杆菌特异混合抗原，刺激这些效应T淋巴细胞分泌γ干扰素。其分泌的INF-γ被微孔板上的特异抗体所捕获，再次加入的碱性磷酸酶标记的抗体针对INF-γ不同表位结合，并滞留于微孔板表面。底物溶液显色并在反应部位被酶分解后形成不溶性色素沉淀斑。斑点数代表γ干扰素分泌细胞数量。对斑点进行计数后可以检测腹腔液内是否存在对核菌反应的效应T细胞，从而辅助诊断结核杆菌感染情况。与ELISA相比，ELISPOT法更灵敏，它可以从20万-30万单个核细胞中检出一个分泌该蛋白的细胞。

以往有文献采用PCR法检测胸腹水中TB-DNA[3]，本实验对腹腔积液用TB-ELISPOT法与TB-PCR法相比，结果表明EIISPOT具有较高敏感性。使用的结核杆菌培养滤液蛋白CFP-10和特异性抗原多肽ESAT-6，其特异性良好，可达94.4%。并且可以避免接种卡介苗(BCG)及其他分枝杆菌感染的交叉反应，只要对其中一种多肽的T细胞反应达到要求就可判读为阳性[4]。以往对于结核性腹膜炎的诊断多根据临床特点及影像学检查，而本实验采用对腹腔液分离其中的单个核细胞进行结核杆菌EIISPOT法检测，这样可以直接地进行结核性感染的诊断，具有很好的特异性及敏感性，是一种较为理想的实验室辅助诊断方法。

参考文献：

[1]谷旭红,阎振元,周清龚,等.腺苷脱氨酶与癌胚抗原的测定在结核性与癌性胸水鉴别诊断中的意义[J].河南诊断与治疗杂志,2002, 7（6）：402-403.

[2]LalvaniA,PathanAA,McShaneH，et a1.Rapid detection of Mycobacterium Tuberculosis infection by enumeration of antigen specific T cells[J]. Am J Respir Care Med,2001,163(4):807-808．

[3]孙庆.荧光定量聚合酶链反应快速检测胸腹水抗酸杆菌的临床应用[J].国际检验医学杂志，2011，32（13）：1479-1480.

[4]Philip C,Dolly Jackson-Sillah，Annette Fox，el a1．ESAT-6/CFP-10 Fusion Protein and Peptides for()primal Diagnosis of Mycobacterium Tuberculosis Infection by Ex Vivo Enzymelinked in Gambia[J]．J Clin Microbiol，2005，43(5)：2070-2074．