重组PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术检测抗HCMV

作者：王清,王锡波,徐龙强,于维林,于红,张文卿

【关键词】 巨细胞病毒

Recombinant PP150 of human cytomegalovirus as antigene for colloidal gold immunodot assay to detect HCMVIgM in sera

【Abstract】 AIM: To use recombinant pp150 of human cytomegalovirus (HCMV) in colloidal gold immunodot assay (CGIDA) for the detection of HCMVIgM in sera. METHODS: A fragment of gene coding for pp150 antigen epitopes (840-1048aa) was expressed in E. coli and the fusion protein was purified. The results were compared with those of specific antibodies ELISA IgM. RESULTS: Recombinant antigen CGIDA had a good agreement (96.0%) with ELISA kit. The specificity of CGIDA was 100% and the sensitivity was 74.2%. CONCLUSION: Recombinant pp150 is an effective and valuable antigen used in CGIDA for detecting HCMVIgM.

【Keywords】 cytomegalovirouses,human;gene pp150;prokaryotic expression; gold colloidal; immunodot assay

【摘要】 目的: 探索应用重组人巨细胞病毒(HCMV)PP150抗原用于免疫滴金技术检测血清中抗HCMVIgM的诊断价值. 方法: PCR扩增HCMV pp150抗原决定簇（840～1048aa）编码基因片段，插入原核表探索应用重组人巨细胞病毒(HCMV)PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术（CGIDA）检测血清中抗HCMVIgM的诊断价值. 达载体pMAlp2，转化宿主菌E.coli，诱导表达及纯化. 重组抗原CGIDA与酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒对比检测. 结果： 重组抗原CGIDA与ELISA试剂盒比较,符合率达96.0%；CGIDA检测HCMVIgM的敏感度为74.2%，特异性为100%. 结论: 重组抗原pp150用于 CGIDA对HCMV的早期诊断，具有较好应用价值.

【关键词】 巨细胞病毒, 人；基因pp150;原核表达；胶体金;免疫斑点法

0引言

胶体金免疫斑点法(colloidal gold immunodot assay,CGIDA)快速简便，吕贯廷等［1］成功地建立了CGIDA检测HCMVIgG的方法，但国内关于抗人巨细胞病毒(HCMV)IgM的临床检测的报道较少. 我们用基因工程方法合成HCMV pp150（841~1084aa）抗原,以胶体金为标记手段,建立了检测血清抗pp150 IgM抗体的胶体金免疫斑点法.

1材料和方法

1.1材料

HCMV AD169毒种、宿主菌E.coli DH5α, 原核表达质粒pMAlp2为山东省分子病毒学重点实验室提供. EcoR I, HindⅢ, T4 DNA Ligase, Wizard PCR Preps DNA Purification System, Wizard Plus Minipreps DNA Prurification Systems, IPTG, 硝酸纤维素膜（孔径0.65 μm）等均购自Promega公司. 麦芽糖结合蛋白(MBP)纯化树脂购自BioRad公司. 抗人IgM及HCMVIgM ELISA试剂盒由山东省分子病毒学重点实验室提供. HCMV IgM阳性血清120份经青岛大学医学院附属医院妇产科研究室提供（晶美生物工程有限公司人巨细胞病毒IgM ELISA试剂盒检测）; 266份临床血清采自青岛大学医学院附属医院正常孕妇. 正向引物： 5′TGGCGAATTCACCTCTTCCGCTTCTTCGGC3′，反向引物：5′GTGTTAAGCTTCTATTCCTCCGTGTTCTT3′，PCR产物长度为651 bp,产物上游酶切位点为EcoR1，下游酶切位点为HindⅢ.

1.2方法

1.2.1重组pp150抗原的制备HCMV AD169株接种人胚肺二倍体细胞，待细胞出现病变()后，收集细胞，提取总DNA作为模板，通过PCR扩增出HCMV pp150多个强抗原决定簇区目的基因. 分别用限制性内切酶EcoR I, HindⅢ酶切上述扩增片段和质粒pMALp2，回收酶切产物和载体片段，然后进行连接反应. 将连接产物转化感受态宿主菌E.coli DH5α，挑取经鉴定的单个菌落，37℃培养至A600 nm约为0.5. 加ITPG分别诱导1, 2, 3, 4, 5 h后收集菌体，在50 mmol／L TrisHCl（pH 8.0）溶液中超声波裂解（12 s/次，共3次），将沉淀溶于包涵体溶解缓冲液中(8 mol／L尿素，100 mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，0.1 mmol／L PMSF，50 mmol／L TrisHCl，pH 8．0)，4℃, 6000 g离心10 min，回收上清. 每隔1 h用复性液(10 mmol／L GSH， 2 mmol/L GSSG，50 mmol／L TrisHCl，pH 8．0),将尿素浓度逐步降低到0.5 mmol／L，4℃复性过夜，在透析液(50 mmol／L TrisHCl，pH 8.0)中4℃充分搅拌去除剩余尿素. 4℃, 6000 g离心10 min，取上清，复性蛋白1．5 mL (0．5 g／L)上样，用麦芽糖结合蛋白（MBP）纯化树脂纯化（具体操作见说明书）. 应用150 g/L SDSPAGE检测表达及纯化情况.

1.2.2CGIDA试剂盒的置备及检测方法在300 mL双蒸水中加入10 g/L枸橼酸钠4.5 mL，煮沸后迅速加入0.2 g/L氯金酸3.6 mL ，继续煮沸10～15 min，冷却后用0.1 mol/L碳酸钾调pH值至8.5；取已纯化抗体作线性稀释，每管加入制备好的胶体金溶液1 mL，静置2 h,以保持红色不变的最小量管为胶体金与待标记蛋白的最适比例；取已纯化的抗原多肽与水溶性碳化二亚胺活化过夜，用PBS透析1 d；以3 mL胶体金溶液为基准，加入抗人IgM迅速混匀，15 min后加入10 g/L稳定剂7.5 mL，混匀，以1000 g 10℃离心40 min，弃上清夜，沉淀重悬于等体积10 g/L稳定剂(pH 7.2～7.4)中，1000 g 10℃离心30 min，弃上清液，沉淀用1/5体积恢复液恢复. 用孔径为0.65 μm的硝酸纤维素膜制成1 cm直径的方片， PP150蛋白、HCMVIgM（阳性对照）、PBS（阴性对照）3×3的点阵滴定后，将活化抗原稀释至浓度为0.25 mg/L，直接滴加于载体膜上，室温干燥后用10 mL/L牛血清白蛋白（BSA）封闭，再用10 μmol/L PBS洗涤3次，干燥后于4℃中保存. 将已凉干的抗原膜片装入塑料小盒中，盒内充满吸水材料；在膜盒的中央分别滴加血清标本,人HCMVIgM, PBS各15 μL，待渗入后用10 μmol/L PBS洗涤3次，加入胶体金标记抗人IgM,观察结果，阳性者在膜中央出现红色斑点，阴性者则无红色斑点形成. HCMVIgM ELISA的检测按试剂盒说明书操作. CGIDA检测120份HCMVIgM阳性血清标本，同时检测100例单纯疱疹病毒Ⅰ型IgM阳性血清标本. 免疫斑点检测试剂在4℃下放置6 mo,每月检测抗HCMVIgM阳性及阴性血清各30份. 于37℃和4℃均放置1 wk,然后分别检测阳性和阴性血清各50例作稳定性试验.

2结果

2.1目的基因的PCR扩增PCR扩增产物长度为651 bp，其中目的基因为624 bp，扩增产物两端引入限制性内切酶识别位点序列、保护性碱基共27 bp. 核苷酸片段大小与预期值一致，阴性对照未增出特异性片段（Fig 1）.

2.2原核重组表达质粒的鉴定少量碱裂解法快速提取重组质粒经EcoR I及HindⅢ双酶切后电泳见2条带,分别约为6.7 kb和624 bp，与预测结果一致，证明重组克隆成功（Fig 2）.

2.3SDSPAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色鉴定重组蛋白的检测分析菌体裂解液，表明诱导表达产物主要存在包涵体中. SDSPAGE蛋白电泳显示pMAlP2PP150克隆全菌裂解物在Mr 64 000的位置出现一条蛋白条带，而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置的无蛋白条带；含质粒pMAlP2的诱导菌则在Mr 43 000位置出现一条带. 电泳结果与理论预测值相一致. 另外，从蛋白带型来看，诱导5 h的融合蛋白表达量最高，经凝胶成像系统扫描分析，融合蛋白含量占全菌体的10%. 纯化的融合蛋白经SDSPAGE及考马斯亮蓝染色后，融合蛋白Mr 64 000位置出现一清晰蛋白条带，pMALp2转化菌诱导表达的MBP则出现于Mr 43 000位置.

2.4重组蛋白的抗原性随机挑选15份IgM阳性患者血清进行Western印迹检测，其中12份与表达的融合蛋白有反应，检测的20份IgM阴性血清均为阴性，表明此融合蛋白识别IgM特异性抗体的识别率为80%. 阳性血清与MBP无反应.

2.5CGIDA检测HCMV IgM纯化重组抗原CGIDA检测正常孕妇血清标本266份，其中14份阳性，阳性率为5.3%，与ELISA试剂盒检测阳性率为6.0%比较，符合率为96.0% （Tab 1）.表1重组抗原CGIDA与ELISA检测结果比较（略）

2.6CGIDA检测HCMV IgM敏感性与特异性HCMV IgM阳性血清标本120份中，检出阳性标本89例，同时检测100例单纯疱疹病毒Ⅰ型IgM阳性血清标本，结果均为阴性. 可见，重组抗原CGIDA检测HCMV IgM方法的敏感性为74.2%，特异性为100%. 免疫斑点检测试剂在4℃下放置6 mo,每月检测抗HCMV IgM阳性及阴性血清各30份,其特异性和敏感性非常稳定. 于37℃和4℃均放置1 wk,然后分别检测阳性和阴性血清各50例,二者差异没有显著性.

3讨论

血清特异性IgM检测是诊断急性或活动性HCMV感染的重要方法，但是由于迄今采用的抗原仍是通过细胞培养获得的全病毒抗原，而HCMV病毒本身含有与单纯疱疹病毒和细胞膜成份(mp60)等的交叉抗原,病毒虽经纯化也难以避免由于交叉抗原引起的非特异反应. 同时由于HCMV培养周期长和病毒产量低等原因使HCMV纯化困难较大. 我们克服了用感染的人胚肺二倍体细胞培养物制备全病毒抗原需严格的防护条件、产量有限、稳定性欠佳、与其他疱疹病毒有交叉反应等不利因素.

DNA重组技术的发展使得大量选择性地制备病毒抗原或抗原性片段成为可能，研究表明,将一种或几种重组蛋白作为抗原即可检测HCMV阳性血清. Rolf等［2］用PCR方法扩增HCMV 8种不同开放读码框架的DN段，并表达了相应的重组蛋白，免疫印迹结果表明只有病毒蛋白的3种重组多肽对血清学诊断是必需的. PP150 的495~691aa片段是确诊HCMV既往感染的最适抗原（IgG结合表位）；而862~1048aa片段（IgM结合表位）是急性感染的最佳血清学标志物之一. 国内周铁群及王清等研究证实,HCMV主要结构蛋白PP150的羧基末端部分是HCMVIgM的重要结合表位，在检测HCMV原发及急性期感染中起着极其重要的作用［3，4］.

我们构建了含有HCMV特异性强抗原决定簇片段的重组抗原（841~1084aa）,用Westernblot检测了15份HCMV IgM阳性患者的血清，其中12份发生阳性反应，阳性识别率为80.0%. 目前国内检测血清抗HCMVIgM主要采用间接ELISA法，但该法检测所需时间长，操作步骤繁琐、易受类风湿因子等的影响，所以结果不稳定. CGIDA与酶联免疫分析法比较［5］具有多方面的优点:①不需要酶标检测仪等仪器,更适合现场应用;②实验结果和胶体金试纸可长期保存;③省去底物反应这一步,加快了检测速度;④胶体金标记蛋白质时金颗粒与蛋白分子之间的结合属于物理吸附过程,所以整个标记过程对蛋白质的生物活性影响很小,且易获得较高的标记率;⑤胶体金不属于生物活性物质,干扰检测结果的因素将大大减少. 本研究比较了CGIDA与商品化ELISA试剂盒检测结果,符合率为96.0%，敏感性为74.2%，特异性100%，研究结果表明重组抗原pp150用于CGIDA对HCMV的早期诊断，具较好的应用价值.

【参考文献】

［1］ 吕贯廷，郭晏海，卢冰，等. 胶体金免疫斑点法检测人巨细胞病毒pp150抗体［J］.临床检验杂志，2002；20（6）：358-359.

Lü GT, Guo YH, Lu B, et al. Detection of IgM antibodies to HCMV PP150 by Coloidal Gold Immunodotting Assy［J］. Chin J Clin Lab Sci, 2002;20（6）:358-359.

［2］ Rolf V, Vornhagen R, Plachter B, et al. Early serodiagnosis acute human cytomegalovirus infection by enzymelinked immunosorbent assay using recombinant antigens［J］. J Clin Microbio,1994;32(4):981-986.

［3］ 周铁群，沈月雷，邱平,等. 人巨细胞病毒大外膜磷蛋白pp150羧基末端的高效表达及初步应用［J］. 微生物学免疫学进展，1999；27(2)： 28-31.

Zhou TQ, Shen YL, Qiu P, et al. High efficiency prokaryotic expression of the carbox terminus of human cytomegalovirus phosphorylated tegument protein pp150 and preliminary application for detectin of HCMV IgM［J］. Microbiol Immunol Progress，1999;27(2): 28-31.

［4］ 王清，张文卿，于红. 人巨细胞病毒pp150基因的原核表达及抗原性分析［J］.青岛大学医学院学报，2003；39（1）:23-25.

Wang Q, Zhang WQ, Yu H. Prokaryotic expression of human cytomegalovirus pp150 gene and its antigenicity analysis［J］. Acta Aacad Med Qingdao Univ, 2003;39（1）:23-25.

［5］ 陈小锋,刘曙照. 胶体金标记免疫分析及其在小分子化合物快速检测中的应用［J］. 药物生物技术, 2004;11(4):278-280.