局部深低温对脊髓损伤大鼠神经再生和硫酸软骨素蛋白多糖mRNA表达的影响

摘要：目的 探索局部深低温对脊髓损伤大鼠硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)基因表达和轴突再生的影响。方法 54只成年SD大鼠被随机分为三组：假手术组（n=6），脊髓损伤组（n=24）和脊髓损伤+低温组(n=24)，建立动脉瘤夹钳夹脊髓损伤模型，在使用硬膜外灌流装置保持干预组低温状态120min后，缓慢复温至37℃。通过Realtime-PCR 检测脊髓损伤大鼠伤后NG2 、neurocan和Brevican的表达，通过LFB染色观察大鼠脊髓脱髓鞘程度并使用大鼠后肢BBB评分评估局部低温对于脊髓损伤后运动功能恢复的影响。结果 ng2、Neurocan的mRNA表达在伤后8d左右（Brevican 14d）达到高峰，与损伤组相比，低温组在伤后8d和14d的表达水平显著降低(P

关键词：深低温；脊髓损伤；轴突再生；硫酸软骨素蛋白多糖

Effects of Regional Profound Hypothermia on Axon Regeneration and Chondroitin Sulfate Proteoglycans' mRNA

Expression in Rats with Spinal Cord Injury

XU Xiao-yu1,2,CHENG Hui-lin1

(1.School of Medicine,Nanjing University ,Nanjing 210002,Jiangsu,China;2.Department of Neurosurgery,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region,Nanjing 210002,Jiangsu,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of regional profound hypothermia on the mRNA expressions of chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs) and axon regeneration inrats with spinal cord injury. Methods56 rats were randomly assigned into sham-operated (n=6), spinal cord injury (SCI) (n=24), SCI+Hypothermia (n=24) groups. Spinal cord injury models were established by clamped on T10 with aneurysm clip. An epidural perfusion device was applied to maintain a steady temperature (18℃) for 120min with gradual re-warming to 37℃. The mRNA expressions of NG2, Neurocan and Brevican were tested by real-time PCR. The Luxol Fast Blue (LFB) stain were used to observe the morphology features of spinal cord. The motor function of hind limbs (BBB score) was monitored for 21 days. ResultsThe mRNA expressions of NG2, Neurocan, Brevican were significantly downregulated by hypothermia at 8D and 14D after spinal cord injury(P

Key words：Spinal cord injury; Hypothermia; Axon regeneration; Chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs)脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）作为一种伴发多种并发症[1]的严重的中枢神经系统损伤，在当代社会的发病率逐年升高，给个人、家庭及社会造成了严重的负担。低温作为一种公认的具有神经保护作用的治疗手段，在脊髓损伤的治疗中逐渐显现出重要的作用，但是关于低温神经保护作用的机制仍未完全了解。

硫酸软骨素蛋白多糖是一种广泛存在于中枢神经系统基质中的分子物质，其在神经的发育、成熟及损伤后的生理、病理过程中都起到了举足轻重的作用。在中枢神经系统损伤后，GSPGs可以在胶质瘢痕中富集并阻止神经的再生[2-3]。

1资料与方法

1.1一般资料雄性SD大鼠54只，体重220~250g，其中假手术组6只，脊髓损伤组24只，脊髓损伤+低温组24只。制作脊髓损伤及低温模型。

1.2方法大鼠分为假手术组、损伤组和损伤+低温组（每组大鼠6只）。使用Mx3000p系统行RNA扩增。从损伤组和低温组每组随机选取6只大鼠，取伤灶处脊髓组织制备横断面的石蜡切片（8mm）。按标准步骤行坚牢蓝染色。术后后肢运动功能评价使用BBB运动评分表。由2位观察员进行盲法评分。

1.3统计分析应用SPSS 19．0统计软件分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，两组之间比较采用两独立样本t检验。

2结果

2.1 NG2, Neurocan和Brevican mRNAs 的表达变化 除了Brevican 之外，NG2和Neurocan的mRNA水平在损伤后2d开始升高，8d左右达到峰值，brevican的mRNA水平在伤后2d有一定的降低，然后逐渐升高，在14d左右达到一个相对较高的水平，与损伤组相比，低温组的mRNA水平均有所降低（NG2 2D P

2.2 LFB染色 伤后21d观察两组的脱髓鞘情况，两个代表性视野取自脊椎后角处，与损伤组（左图）相比，低温组（右图）的脱髓鞘和空泡化程度明显降低。见图2。

图2LFB染色（箭头为空泡化改变 400倍视野）

2.3后肢运动功能评分对照组各时间点评分均为满分21分；低温组大鼠的后肢BBB评分在7d（SCI+Hypothermia 9.15±1.02；SCI 6.33±0.58 P ＜0.05）、14d（SCI+Hypothermia 13.25±1.26；SCI 9.75±0.96 P＜0.01）和21d（SCI+Hypothermia 15.25±1.32；SCI 12.25±0.86 P＜0.05）明显高于损伤组。

3讨论

全身低温不仅增加了心律失常和肺炎的发生率，而且能够引起像寒战、免疫抑制和凝血障碍等严重后果[1]。而局部低温能很大程度上避免上述并发症的出现。在本实验中，我们使用了硬膜外低温生理盐水灌注来诱导局部深低温，该种方法能快速（10min内）将伤灶处温度降低到理想水平（18℃），并通过调节液体的灌流速度使低温维持稳定长达2h，这些都说明了在未来的脊髓损伤治疗中，硬膜外局部深低温可以作为一种稳定的、可靠的治疗方式在临床上使用。

胶质瘢痕和 CSPGs是C N S受损后神经元轴突再生的主要抑制分子，本研究发现局部深低温可以下调脊髓损伤后几种主要的硫酸软骨素蛋白多糖的基因表达，在脊髓损伤后，CSPGs可以通过与其受体结合，通过不同的信号通路激活RhoA-ROCK，最终引起对轴突再生的抑制[5]，我们推断低温可以通过减少NG2等CSPGs的基因表达，继而减少其下游效应分子的激活，减轻了其对神经再生的抑制作用。

4结论

局部深低温可以减轻大鼠脊髓损伤后的脱髓鞘程度，同时促进后肢运动功能的恢复，这些保护作用可能与低温下调CSPGs的表达有关。局部深低温作为一种具有明确神经保护作用的、并发症较少的干预措施，具有较高的临床应用价值。

参考文献：

[1]李景伟,冯世庆,焦新旭,等.急性脊髓损伤患者早期并发症及危险因素分析[J].中国脊柱脊髓杂志,2011,21(7):569-572.

[2]Bartus K, James ND, Bosch KD, Bradbury EJ. Chondroitin sulphate proteoglycans: key modulators of spinal cord and brain plasticity [J]. Exp Neurol,2012,235(1):5-17.

[3]Sharma K, Selzer ME, Li S. Scar-mediated inhibition and CSPG receptors in the CNS [J]. Exp Neurol,2012,237(2):370-378.

[4]Davies SJ, Fitch MT, Memberg SP, Hall AK, Raisman G, Silver J. Regeneration ofaxons in white matter tracts of the central nervous system [J]. Nature,1997,390(6661):680-683.