左归丸对D-半乳糖致亚急性衰老大鼠ATP酶及Bcl-2 Bax和Caspase-3表达的影响

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摘 要:左归丸出自《景岳全书》,是公认的抗衰老古方,本研究旨在通过观察左归丸对d-半乳糖致亚急性衰老大鼠atp酶及细胞凋亡相关因子bcl-2、bax和caspase-3表达的影响,从实验的角度探讨抗衰老古方左归丸的延缓衰老作用机制。结果显示D-gal可以造成大鼠肝、脑组织中ATP酶活力降低、脑海马区的Bcl-2、Bax和Caspase-3表达升高,给予左归丸后,大鼠Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力表现出不同程度的升高,Bcl-2的表达上调而Bax和Caspase-3表达下调,提示左归丸的抗衰老作用可能与其提高ATP酶活力以维持细胞膜的稳定性和抑制细胞凋亡作用有关。

关键词:左归丸;衰老;ATP酶;细胞凋亡

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0205-03

The Effect of Zuogui Pill on Atpase Bcl-2 Bax and Caspase-3 of

Subacute Aging Rats Induced by DGalactose

SUN Linlin1,Advisor:KANG Guangsheng2,MA Yanchun3

(1.Department of Combining TCM with Western Medicine in Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157011, Heilongjiang ,

China; 2. Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, Heilongjiang ,China)

Abstract:To observe the effect of Zuogui Pill on ATPase and expressions of Bcl2, Bax and Caspase3 which are agents related with apoptosis in subacute aging rats induced by Dgalactose (Dgal), to use Liuweidihuang Pill as control and to approach the function's mechanisms preliminarily of Zuogui Pill as an archaic antiaging formula. Dgal can result in the cutting down of ATPase in the liver and brain of rats and the stepping up of the expression of Bcl2, Bax and Caspase3 in the hippocamp zone of rats' brain. After the intervention of Zuogui Pill, the activity of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase and the expression of Bcl2 rise in different degree and the expressions of Bax and Caspase3 descend. The antiaging function of Zuogui Pill may be concerned with that this formula can raise the activity of ATPase to retain the stability of cell envelope and restrain apoptosis.

Key words:Zuogui Pill; insenecence; ATPase; apoptosis

左归丸出自《景岳全书》卷51,由熟地、山茱萸、山药、枸杞子、牛膝、菟丝子、龟板胶和鹿角胶组成,功能滋阴补肾、填精益髓,可用于治疗“真阴肾水不足”、“精髓内亏”所致的虚损表现,具有延缓衰老的作用。自由基氧化致衰理论一直是抗衰老研究的热点,自由基增加不但与降低的抗氧化能力有关,还能导致细胞膜稳定性降低、细胞钙稳态失调和细胞凋亡的发生。本研究在前期相关实验的基础上,进一步观察了左归丸对D-半乳糖致亚急性衰老大鼠ATP酶及细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响,探讨了本方对衰老大鼠细胞膜稳定性、钙稳态和细胞凋亡的调节作用,现将结果报道如下。

1实验材料

1.1实验动物

健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,体重(300±20)g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2实验用药及制备

左归丸和六味地黄丸为河南省宛西制药股份有限公司生产,产品批号分别为071003和070359。用研钵将左归丸和六味地黄丸分别研磨成细粉,再加入蒸馏水,左归丸配制成含药0.081g/mL的混悬液,六味地黄丸配制成含药0.162g/mL的混悬液,每周制备1次,4℃保存备用,每次使用前加温至37℃。

1.3实验主要试剂

ATP酶测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,Bcl-2、Bax和Caspase-3免疫组化试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

2实验方法

2.1实验动物分组

将60只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、六味地黄丸组和左归丸组,每组10只,适应性饲养1周后开始造模。

2.2造模及给药方法

采用D-半乳糖(D-gal)致亚急性衰老法[1]造成大鼠亚急性衰老模型。首先,将D-半乳糖5000mg溶于500mL生理盐水中,配制成10mg/mL浓度的注射液,按注射剂量125mg•kg-1•d-1(即每克体重注射0.0125mL D-半乳糖溶液)给大鼠腹腔注射,正常对照组注射等体积生理盐水,各组大鼠每周称重1次,根据末次称重的体重克数调整给药剂量,连续造模8周。

六味地黄丸组和左归丸组从第1天造模开始每日上午按10mL/kg分别灌胃给与相应治疗药物,正常对照组和模型对照组给予相应体积的生理盐水,每日1次。按照实验大鼠与正常人的体表面积比例系数折算后,确定六味地黄丸组和左归丸组每日灌服剂量均为1.62g/kg,大鼠每周称重1次,依据末次称重的体重克数调整给药剂量,连续给药8周。

2.3观察指标及检测方法

观察指标包括:肝、脑组织中的ATP酶活力和脑海马区的Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达。以上指标检测均按照试剂盒提供的方法及要求进行操作。

3实验结果

3.1左归丸对D-gal致衰老大鼠肝 脑组织ATP酶活力的影响

从表1和表2可以看出:模型对照组大鼠ATP酶活力明显低于正常对照组,差异具有显著性(P

3.2左归丸对D-gal致衰老大鼠脑海马区Bcl-2 Bax和Caspase-3表达的影响

从表3可以看出:模型对照组大鼠脑海马区的Bcl-2、Bax和Caspase-3表达明显高于正常对照组,具有显著性差异(P

4讨 论

祖国医学认为衰老的内因与肾中精气的盛衰密切相关,肾精亏虚是衰老发生的内在的根本性机制之一,故左归丸可以通过其补肾填精的作用达到延缓衰老的目的。曾有人提出[2]延缓衰老,应以保精护肾为要务,强健体质亦应以此为关键。现代药理研究亦发现[3]补肾填精中药复方可以影响细胞周期,减缓细胞衰老。

D-gal致亚急性衰老模型可以出现糖代谢的紊乱,产生大量自由基,引起氧自由基介导的生物损伤效应,包括降低ATP酶活性和诱导细胞凋亡。机体内过量的自由基可以对酶的结构造成直接损伤,如氧化Ca2+-Mg2+-ATPase的必需基团――巯基蛋白,使ATP酶的活性下降;另外过量自由基引起的脂质过氧化可以引起膜的流动性发生改变,也能影响酶的集聚[4]。自由基在体内过量还可引起不同程度的细胞毒反应和极瞬间的不可逆损伤,造成细胞凋亡。近年来,大量研究证明自由基尤其是活性氧自由基(ROS)是参与调节细胞凋亡的重要因素之一,许多化学物质如砷剂诱导细胞凋亡就是通过提高细胞中ROS的含量实现的[5]。本实验结果显示,注射D-gal可以使大鼠出现ATP酶活性降低,脑海马区的Bcl-2、Bax和Caspase-3表达明显上调。

Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase存在于细胞膜上负责细胞内外离子平衡,可以将进入细胞内的钙泵到细胞外,从而保持细胞内钙低浓度而细胞外高浓度的钙稳态状态。随着年龄增加,Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性下降,势必引起神经细胞内游离钙浓度增加,最终引起钙稳态的失调,细胞内钙超载,从而加速细胞的衰老[6]。提高Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性能起到抗自由基和维持钙稳态的作用,故在一定程度上可以起到延缓衰老的作用。本实验结果显示,左归丸能提高Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性,说明本方能促进维持细胞膜的稳定性和钙稳态状态,从而发挥延缓细胞衰老的作用。

Bcl-2是抑制凋亡的关键因子,参与细胞衰老[7],其过度表达可有效阻止包括细胞密度、培基营养性成分缺乏、代谢产物积累、激素、温度波动、供率不足、pH变化、过氧化氢、自由基、微生物污染等诱发的细胞凋亡。Bax的主要作用是加速细胞凋亡,并与Bcl-2一起调节细胞凋亡。它不仅能和Bcl-2形成异源二聚体(Bcl-2-Bax,heterodimer)抑制凋亡,而且其自身还能形成同源二聚体(Bax-Bax,homodimer)诱导凋亡[8]。细胞凋亡有一个由多分子参与的生化通路,该通路中的核心分子是一族叫做Caspase(半胱氨酸蛋白酶)的蛋白水解酶[9],是细胞凋亡过程的主要执行者,是哺乳动物中最主要的凋亡效应因子[10],其中Caspase-3是各凋亡通路下游进行底物酶解的共同的关键蛋白酶,作为凋亡的效应因子被称为凋亡的执行者。通常认为Bcl-2作用在Caspase-3激活的下游,通过抑制其激活而抑制细胞凋亡,Caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用。本实验结果显示,给予左归丸后抑制凋亡的关键因子Bcl-2表现出应激性的表达上调,而加速凋亡因子Bax和Caspase-3表达下调,说明本方的抗衰老作用可能与调节细胞凋亡相关因子的病理性表达以抑制细胞凋亡有关。

随着人口老龄化趋势的加快,抗衰老研究日益受到重视。左归丸是公认的抗衰老古方,本研究亦发现本方具有延缓实验性衰老的作用,其作用机制可能与提高细胞膜的稳定性、维持钙稳态和抑制细胞凋亡有关。

参考文献

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