骨碎补总黄酮对骨质疏松大鼠Smad1 Smad5基因表达的影响

摘 要:目的:通过手术切除SD大鼠的双侧卵巢,建立绝经后骨质疏松模型,研究骨碎补总黄酮对骨质疏松大鼠Smad1、Smad5 mRNA表达的影响,从而在基因水平说明其影响成骨的机制。方法:(1)动物造模:60只12周龄SD大鼠,随机分成正常组、空白组和倍美力组及骨碎补总黄酮高、中、低剂量6组,每组10只,正常组麻醉后仅切除腹部与卵巢等重量的脂肪,其余50只麻醉后从腹部入路切除双侧卵巢。(2)处理方法:①正常组、空白组标准饲料常规饲养24周。②骨碎补总黄酮3组在用标准饲料喂养12周后,第13周开始在继续用标准饲料喂养的同时每天灌服骨碎补浓缩剂12周。③倍美力组在标准饲料常规喂养12周后,第13周开始在标准饲料常规喂养的同时每天灌服倍美力悬剂12周。④24周后处死大鼠切取右侧股骨,测Smad1、Smad5 mRNA。结果:空白组Smad1 mRNA的表达是正常组的40%,有统计学意义(P

关键词:骨碎补;大鼠;Smad;基因;机制

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0200-05

Effects of Drynariae Rhizoma Total

Flavone on Smad1 Smad5 mRNA Expression in Osteoporotic Rats

ZHU Huifeng1,WANG Weijia2,WANG Zhumei1

(1.Department of Orthopaedics ,Yuhang District 2nd Hospital of Hangzhou, Hangzhou 311121,Zhejiang,China;

2.Traditional Chinese Medicine Hospital of Zhejiang, Hangzhou 310005,Zhejiang,China)

Abstract:Objective:Creating rat osteoporosis model by ovariectomy ,to study the effects of Drynariae Rhizoma Total Flavone on Smad1,5-mRNA expression in ovariectomied Rats, in order to explain its mechanism of bone generation in gene level.Methods:(1)Animal mode creating: Total of 60 SD rats 12 weeks old were divided to 6 groups randomly, 10 rats each: normal group, blank control group ,premarin group, high dose\\middle dose\\lower dose Drynariae Rhizoma Total Flavone group. All rats were ovariectomied except normal group.(2)Treating methods:① normal and blank control group were feed in general process for 24 weeks.②Drynariae Rhizoma Total Flavone group were feed with Drynariae Rhizoma Total Flavone in three kinds different concentration for 12 weeks after ovariectomied 12 weeks; ③Premarin group were feed with premarin for 12 weeks after ovariectomied 12 weeks.④ Kill rats and collect right femur bone to detect Smad1、Smad5. Results:Compared to the normal group ,Smad1 of blank control group is 40% (P

Key words:drynariae rhizoma total flavonerat smad1 smad5;gene expression;mechanism

骨质疏松症是严重影响老年人生活质量的常见病之一,它以骨量减少,骨组织显微结构退化,骨折危险度增加为特征,治疗非常棘手。中医药在治疗该病方面有明显优势。在众多补肾中药的研究中,不管是复方还是单味药,尽管疗效确切,但都存在药物成份的不明确性。因此,国内外科研工作者都试图研究一类不但疗效确切,而且成份明确的中药产品。骨碎补总黄酮就是这个背景下的产物,它是补肾中药骨碎补的提取物,有效成份明确,不含其它可能具有不同药理作用的成份,其提取物和提取工艺已获得国内国际专利,是国家九五科技攻关项目。

在骨碎补总黄酮治疗骨质疏松症的机理研究方面,已有的研究证实,骨碎补总黄酮能较可靠地提高骨矿物质含量,并且动物实验也说明了这一点。有学者分别从成骨细胞和破骨细胞两方面说明了骨碎补总黄酮抗骨质疏松的细胞机制,分析了骨碎补总黄酮抗骨吸收的分子机制。

Smads蛋白是在TGF-β家族成员的细胞内信号传导中起重要作用的转录因子,传导的是Ⅰ型和Ⅱ型丝苏氨酸激酶受体下游的信号,其中与成骨密切相关的是Smad1、Smad5。

本研究通过骨碎补总黄酮对骨质疏松大鼠喂养后Smad1、Smad5 mRNA表达的影响,试图从基因水平揭示骨碎补总黄酮对骨质疏松大鼠骨质疏松症的治疗原理,为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠60只,雌性,12周龄,体重(240±20)g,购自浙江中医药大学动物实验研究中心。

1.2 实验药品

倍美力水溶液(美国惠氏尔斯特制药公司艾尔斯特药厂制造,生产批号0502090,国药准字2001J-51-2号),水溶液浓度为9.375μg/mL;骨碎补总黄酮(浙江中医药大学中药系制剂室提供),并分成高、中、低3种浓度,浓度分别为0.216、0.108、0.054g/mL。

1.3 实验器材

小鼠灌胃器、烧杯、量桶、752型紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂),美国Biorad伯乐梯度PCR仪;美国Biorad伯乐双通道实时定量PCR仪,型号:DNA Engine Opticon2;Biofuge stratos型超速冷冻离心机;3300 pro UV/VIS型紫外可见分光光度仪(瑞典Amerso Biosciences公司);紫外投射仪(北京六一仪器厂);水平式电泳装置(北京六一仪器厂);GIS-2009型凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)等。

1.4 受试环境

浙江中医药大学动物实验研究中心清洁级大鼠实验室,动物实验条件合格证号:SYXK(浙)2003-0003号。饲养条件一致,标准饲料(由南京安立默科技有限公司生产),室温调节在(24±2)℃,自由摄食与饮水。生物力学测定在浙江大学材料力学研究实验室进行。

1.5 实验方法

1.5.1 动物实验步骤 动物选择与分组:取健康SD大鼠60只,雌性,12周龄,体重(240±20)g,称重后随机分组、编号,共6组:正常组(未切除卵巢)、空白组(切除卵巢未予任何治疗)、倍美力组及骨碎补总黄酮高剂量组、骨碎补总黄酮中剂量组、骨碎补总黄酮低剂量组,每组10只,分12笼喂养。

首先各组大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥(用量:35 mg/kg)达到麻醉效果后,沿下腹正中线作长2cm切口,逐层切开,暴露腹腔。除正常组行假手术,仅切除卵巢附近一小块与卵巢等重量的脂肪组织外,各组切除双侧卵巢,腹腔内注射青霉素20万单位后分两层缝合腹壁。术后3天每天腹腔注射青霉素20万单位,正常喂养12周,第13周起开始给药,每组根据课题设计给予不同的药物进行喂养,即正常组、空白组继续用标准饲料常规喂养12周;骨碎补总黄酮高、中、低剂量3组继续用标准饲料喂养的同时每天灌服骨碎补总黄酮浓缩剂12周;倍美力组在标准饲料常规喂养的同时每天灌服倍美力悬剂12周,灌胃药物量为10 mL/kg,各药物的浓度见表1。

试验过程中每4周称重1次,根据体重调整给药量。24周后,2%戊巴比妥麻醉动物,取右侧股骨剔除软组织, -70℃保存备用。

1.5.2 基因检测 (1)总RNA抽提:取左侧股骨,自然解冻,咬骨钳去除股骨两端,并小心收集骨髓至1.5mL离心管中,加1mL生理盐水冲洗,1200r/min,室温,离心10min,弃上清液。加1mL Trizol,振荡混匀,室温放置5min。加入0.2mL氯仿,颠倒混匀,静置5min;4℃,12000r/min,离心15min。取上层水相0.5mL,加入0.5mL异丙醇,混匀,-20℃放置20min;4℃,12000r/min,离心15min。弃上清液,加入1mL 75%乙醇洗涤,弃上清液,室温晾干5 min,用DEPC处理水20μL冰上溶解RNA,-80℃保存。

经752型紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)OD260/OD280比值为1.85,说明RNA纯度符合要求,浓度平均为1.056μg/μL。

(2)逆转录反应:dNTP 1μL,5×buffer 4μL,RNA酶抑制剂 2μL,组织总RNA 2μL,M-mLV 2μL,Oligo(dT)15 1μL,DEPC H2O8μL。反应条件:42℃60 min,94℃5 min。-80℃保存。

(3)普通PCR及琼脂糖凝胶电泳检测:dNTP 1μL,10×buffer 5μL,Taq DNA聚合酶1μL,上游引物1μL,下游引物1μL(具体引物序列见表2),反转录产物2μL,H2O 39μL。反应条件:94℃,3 min;94℃,40s;55℃,30s;72℃,30s;35个循环。70℃,5 min。4℃保存。

取PCR产物与上样缓冲液混匀后,上样于1%琼脂糖凝胶中,其中第2孔为DNA marker, 85V电压,电泳1.0 h。取出,TANON GIS-2009凝胶成像系统中观看、拍照并做光密度分析。

(4)实时荧光定量PCR:SYBGreen荧光染液25μL,dNTP 0.5μL,10×buffer 2.5μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,上游引物0.5μL,下游引物0.5μL(具体引物序列见表2),反转录产物2μL,H2O 18.5μL。

扩增反应程序设置如下:94℃,3 min;94℃,30s;55℃,30s;72℃,30s;45个循环。荧光信号采集设置在72℃(每循环的第三步反应)。

熔解曲线反应程序设置如下:从55～95℃,步进0.5℃/s。

结果利用2-C(t)法做相对定量分析。采用SPSS 13.0统计软件包进行数据处理,单因数方差分析,对定量分析结果用均数±标准(±s)表示。P

2 结果

在实验过程中,初期由于喂养不当,造成倍美力组、高剂量骨碎补总黄酮组各1只死亡,其余SD大鼠均成活。

普通PCR及电泳结果经TANON GIS-2009凝胶成像系统处理,得到电泳图片(见图1～2);实时荧光定量PCR检测骨碎补总黄酮对骨质疏松大鼠Smad1表达的影响见图3～4;Smad1以及β-Actin的荧光定量PCR熔解曲线图谱和扩增曲线图谱结果见图5～8。

空白组Smad1 mRNA的表达是正常组的40%,有统计学意义(P

与空白组比较,骨碎补总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组的Smad1 mRNA表达均有提高,空白组与骨碎补总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组比较均有统计学意义(P

对骨质疏松大鼠骨髓Smad1 mRNA表达的影响A 对骨质疏松大鼠骨髓Smad1 mRNA表达的影响B

与倍美力组比较,骨碎补总黄酮高剂量组、骨碎补总黄酮中剂量组无统计学意义(P>0.05),骨碎补总黄酮低剂量组有统计学意义(P

实时荧光定量PCR检测骨碎补总黄酮对骨质疏松大鼠Smad5 mRNA表达的影响见图9、图10;Smad5以及β-Actin的荧光定量PCR熔解曲线图谱和扩增曲线图谱结果见图11～14。

空白组Smad5 mRNA的表达是正常组的59.5%,有统计学意义(P

与空白组比较,骨碎补总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组的Smad5 mRNA表达均有提高,空白组与骨碎补总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组比较均有统计学意义(P

与倍美力组比较,骨碎补总黄酮高剂量组、骨碎补总黄酮低剂量组无统计学意义(P>0.05),骨碎补总黄酮中剂量组有显著统计学意义(P

3 分析与讨论

随着社会人口的老龄化,骨质疏松症(Osteoporosis,OP)的危害性日益受到重视,骨质疏松症的潜在危害是诱发骨折,老年人一旦发生骨折(尤其是髋部骨折),将严重影响其生活质量,甚至导致死亡。国内在大量流行病学研究的基础上提出:我国目前骨质疏松症患者(包括骨量减少者)约为8400万人[1],占人口总数量的6.0%,其中绝经后女性发病率最高。因此,在当前和今后相当长的一段时间里,骨质疏松症的防治工作将成为一项紧迫而又艰巨的任务。

对于骨伤科的常用药骨碎补的研究近年来较为活跃,目前国内可见骨碎补对骨质疏松大鼠Smad mRNA表达的影响的研究,但是只涉及骨碎补而未强调骨碎补总黄酮,且只涉及Smad4 mRNA而未涉及Smad1、Smad5 mRNA;国内外可见骨碎补、骨碎补总黄酮或含骨碎补的复方中药对骨组织相关基因表达或水平的影响的研究,但是未涉及Smad mRNA的表达的研究;国内外尚未见骨碎补总黄酮对骨质疏松大鼠喂养后Smad1、Smad5 mRNA的表达的影响的研究。

转化生长因子(TGF-β)超家族包括TGF-βs、activins、inhibin、骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMPs)、MIS(Mullerian Inhibitory Substance)、GD(Growth/Differentiation Proteins)、DPP(Decapentalegic Gene Product)、Vgl、Nodal、Dorsalin等,是具有调节细胞增殖、分化、生长控制,刺激细胞外基质形成,抑制免疫反应,增加黏附分子表达,并与血管生成、骨骼和器官形成、胚胎发育、肿瘤发生等相关的一类信号分子[2]。10年前,研究者发现了脊椎动物体内TGF-β信号转导途径中一个重要的新基因家族――Smads家族[3-4]。近几年中,对Smads的研究以一种惊人的速度进展,体外生化实验以及对Smads基因敲除小鼠的研究帮助研究者理解TGF-β是怎样在体内转导的,并为研究者进一步探讨TGF-β的成员如何调节特定细胞复杂的行为模式提供了重要的线索[5]。

Smads家族中不同的成员在信号转导中起不同的作用。第一类受体激活的Smads包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5,以及可能的Smad8。第二类即通用的Smads到目前发现的只有Smad4。它不能与TGF-β或BMP的Ⅰ型受体相互作用,也不能被磷酸化,但它可与Smads家族中的其它成员相互作用并形成稳定的异源三聚体[6]。这种异源三聚体的形成是TGF-β信号得以转导所必需的,影响三聚体形成的突变可使Smad4失活,这意味着MH2功能域间的相互作用对于信号转导的功能是至关重要的。第三型即抑制型Smads包括Smad6和Smad7,Smad6和Smad7的超表达可以阻断TGF-β超家族中多种成员的信号转导,因而被称为抑制型Smads[7]。

本实验取12周龄的雌性SD大鼠,造成6月龄绝经后骨质疏松症动物模型。切除双侧卵巢但是未予治疗的SD大鼠在36周龄时处死后通过检测发现Smad1、Smad5的表达明显下降,其中,空白组Smad1 mRNA的表达是正常组的40%,治疗后(倍美力组)Smad1 mRNA的表达又基本恢复到正常水平;与空白组比较,骨碎补总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组的Smad1 mRNA表达均有提高,空白组与骨碎补总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组比较均有统计学意义(P

与倍美力组比较,骨碎补总黄酮高剂量组、骨碎补总黄酮中剂量组无统计学意义(P>0.05),骨碎补总黄酮低剂量组有统计学意义(P

空白组Smad5 mRNA的表达是正常组的59.5%,治疗后(倍美力组)Smad5 mRNA的表达又恢复到正常水平。

与空白组比较,骨碎补总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组的Smad5 mRNA表达均有提高,空白组与骨碎补总黄酮高剂量组、中剂量组、低剂量组比较均有统计学意义(P

与倍美力组比较,骨碎补总黄酮高剂量组、骨碎补总黄酮低剂量组无统计学意义(P>0.05),骨碎补总黄酮中剂量组有显著统计学意义(P

骨碎补总黄酮可以上调骨髓微环境中Smad1、Smad5的mRNA基因表达水平,可能是其促进骨形成、修复骨损伤作用的机制之一。

骨碎补为历代常用药物,对其应用和药理作用机制已经有了大量深入、广泛的研究,但其在分子生物学方面机制的研究尚处在起步阶段,补肝肾强筋健骨类中药是否具有相似的调节靶点、调节强度、量效关系及其依时间变化的动态曲线,值得进一步深入研究。

参考文献

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[5]FlandersK C, Sullivan C D, Fujii,M. Mice lacking Smad3 are protected against cutaneous injury in-duced by ionizing radiation[J]. Am JPathol, 2002, 160(3):1057-1068.

[6]Tylzanowski P,Verschueren K,Huylebroeck D,et al.Smad-interacting protein is a repressor of liver/bone/kidney alkaline phosphatase transcription in bone morphogenetic protein-induced osteogenic differentiation of C2C12 cells[J].J Biol Chem,2001,276:401-407.

[7]尚德阳,郑洪新,宗志宏,等.补肾中药对肾虚骨质疏松症大鼠肾组织中Smurf2的mRNA和蛋白表达影响研究[J].中华中医药学刊,2008,26(8):1685.