传统乳制品中降胆固醇作用乳酸菌的分离研究

摘要：文章从中国传统乳制品中分离得到5株乳酸菌纯菌株。通过邻苯二甲醛法测定了每株菌株对培养基中胆固醇的降解能力，其降解率分别为18.4%、50.2%、15.4%、26.9%、24.1%。并通过对降解率最高的菌株L2进行了形态观察、生理生化实验、鉴定及16S rRNA序列分析等研究，鉴定其为干酪乳杆菌。

关键词：中国传统乳制品；降胆固醇作用；乳酸菌

中图分类号：S571 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-06-0097-2

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1样品采集 本研究的乳制品样品均采集于内蒙古海拉尔地区的牧民家庭中。将采集到的传统乳制品保存与灭菌管中，低温运回实验室，置4℃冰箱备用。

1.1.2 仪器 Olympus光学显微镜，超净工作台、厌氧培养箱、Eppendorf全自动高压灭菌锅、梅特勒电子天平、吉尔森移液器、Eppendorf冷冻离心机、GeneQuant100紫外分光光度计、

1.1.3 主要试剂及配制方法 胆固醇、溶菌酶、蛋白酶K、Taq酶、dNTP；16S rRNA引物合成于英潍捷基贸易有限公司；MRS培养基参照《常见细菌系统鉴定手册》中所提供的方法进行配制。MRS-CHOL高胆固醇培养基的配制方法：准确称取1.0g胆固醇，溶于100mL无水乙醇中，此时，溶液浓度为10.0g/L。向100mL MRS液体培养加入1mL 10.0g/L的胆固醇溶液，胆固醇在培养基中的最终浓度约为100mg/L。

1.2 方法

1.2.1 中国传统乳制品中乳酸菌的初筛 将采集的传统乳制品样品于MRS固体培养基平板上划线，置厌氧培养箱中，37℃培养48h。挑选出不同形态的菌落重复划线，于37℃厌氧培养箱中培养24h，重复几次，直至分离得到纯化的乳酸菌。将纯化的乳酸菌菌株穿刺接种在MRS半固体培养基中，37℃厌氧环境下培养24h，保存于4℃备用。

1.2.2 降胆固醇乳酸菌的筛选 胆固醇含量的测定采用邻苯二甲醛法[5]。将分离得到的纯菌株分别接种与MRS培养基中活化2-3代，取1mL菌液接种于5mLMRS-CHOL培养基中，摇匀后立即离心，取上清测定胆固醇的含量。然后混匀，将其置37℃厌氧培养箱中培养24h，离心，取上清测定胆固醇的含量。将同一株纯化菌株同时做10个平行实验，求该菌株的胆固醇降解率的平均值。

胆固醇的降解率=（对照组胆固醇的含量-发酵后胆固醇的含量）/对照组胆固醇的含量。

1.2.3 降胆固醇乳酸菌的生理生化实验 镜检观察具有胆固醇降解作用的乳酸菌的菌体形态，观察平板培养菌落的形态，进行革兰氏染色和触酶实验，对菌株进行初步鉴定。将该菌株接种于糖发酵管中，37℃厌氧培养24h后观察实验结果，对该菌株的属、种进行鉴定。

1.2.4 16S rRNA的分子鉴定 提取筛选到的具有胆固醇降解作用的乳酸菌的基因组DNA，以其为模板，利用细菌16S rRNA的通用引物（Forward Primer：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；Reverse Primer：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′）进行PCR扩增。扩增体系见表1。

PCR扩增的反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并委托天一辉远生物科技有限公司测序。测得序列在NCBI上进行BLAST，与GenBank中的乳酸菌标准株的16S rRNA序列进行同源性比对。

2 结果与分析

2.1 中国传统乳制品中乳酸菌的初筛结果

经过划线纯化，本研究从中国传统乳制品中筛选到5株纯化的乳酸菌菌株，分别命名为L1、L2、L3、L4、L5。

2.2 降胆固醇乳酸菌的筛选结果

5株乳酸菌都具有一定的降胆固醇能力，但是菌株之间差异较大。对照组的胆固醇含量为95.3mg/L，L1、L2、L3、L4、L5的发酵上清中平均胆固醇含量分别为77.8mg/L、47.5mg/L、80.6mg/L、69.7mg/L、72.3mg/L，降解率分别为：18.4%、50.2%、15.4%、26.9%、24.1%。其中，菌株L2的降胆固醇能力最强，降解率达到50.2%，在10次重复实验中，数据没有较大的波动，活性比较稳定。

2.3 菌株L2的形态和菌落特征

该菌株革兰氏染色结果呈现阳性，镜检观察菌体为杆状，单个或链状排列。菌落直径为0.5-1.0mm，边缘整齐，表面光滑，呈乳白色。初步鉴定该菌株为乳酸杆菌属。

2.4 菌株L2的生理生化实验结果

经生理生化实验鉴定，菌株L2与干酪乳杆菌的性质相近。菌株L2的生理生化实验结果见表2。

2.5 16S rRNA鉴定结果

1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增得到约1500bp的片段，如图1所示。将测序的核苷酸序列与GenBank中的标准株序列进行比对，发现菌株L2的16S rDNA与干酪乳杆菌的16S rDNA序列的同源性大于99%，结合生理生化鉴定结果，确定菌株L2为干酪乳杆菌。

3 结论与讨论

本研究发现的L2乳酸菌菌株属于乳杆菌属干酪乳杆菌种。由于乳酸菌在培养基中的生长体系较为复杂，且胆固醇不溶于水，在培养基中可能分布不均匀，所以本研究筛选的实验数据都经过10次平行实验，最后求得平均值，因此，数据结果可靠，菌株的降胆固醇的能力较为稳定。该菌株的降胆固醇能力较强，降解率可达到50.2%，比在发酵肉制品中筛选到的降胆固醇乳酸菌的降解率（24.6%）[6]要高，比在藏灵菇和新疆马奶酒中筛选到的降胆固醇乳酸菌的降解率（50.36%、61.7%）[4，7]略低。

目前，在食品中发现的降胆固醇乳酸菌大多为乳杆菌属，如植物乳杆菌[2，6]、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌[4]等，此外，一些链霉菌属微生物也具有降胆固醇的能力。但是中国传统乳制品中降胆固醇干酪乳杆菌在国内外尚未报道，本文尚属首次。

参考文献

[1] Grill JP,Cayuela C,Antoine JM, et al. Effects of Lactobacillus amylovorus and Bifidobacterium breve on cholesterol[J].Letters in Applied Microbiology,2000,31:154-156.

[2] 汪晓辉,于平,励建荣.泡菜、传统腊肠中降胆固醇乳酸菌的筛选及鉴定[J].微生物学报,2009,49(11):1438-144.

[3] 刘长建,姜波,安晓雯等.菠菜中降胆固醇乳酸菌的筛选及鉴定[J].食品与生物技术学报,2010,29(6):937-940.

[4] 黄颖,隋玉杰,钟莉莉等.藏灵菇发酵乳中降胆固醇乳酸菌的分离及鉴定[J]. 吉林大学学报(医学版),2010,36(6):1181-1185.

[5] Redel LL,Morris MD.Determination of cholesterol using phthalaldehyde[J].J Lipid Res,1973,14,(3):364-366.

[6] 于长青,张丽娜.发酵肉制品中降胆固醇乳酸菌的分离及鉴定[J].食品科技, 2007,8,45-48.

[7] 陆晓娜,杨海燕,阿布力米提.新疆马奶酒中降胆固醇乳酸菌的筛选及性状研究[J].农产品加工•学刊,2006,1:31-33.