稳定表达Syncytin的EL4细胞系的建立及鉴定

摘要：Syncytin是人类内源性逆转录病毒W家族的囊膜蛋白。近期研究发现Syncytin与白血病密切相关。为研究Syncytin的生物学功能，我们克隆了人syncytin，并连接到pIRES2-EGFP质粒上，转化该质粒至感受态大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆进行PCR、酶切电泳和DNA测序鉴定，成功构建了表达syncytin基因的真核表达载体。利用罗氏转染试剂转染重组质粒至EL4细胞，并通过G418选择性培养基筛选，在荧光显微镜下观察细胞中Syncytin表达，用RT-PCR、Western blot检测Syncytin表达水平，结果显示我们成功构建了稳定表达人Syncytin的ELA细胞系。稳定表达人Syncytin的EL4细胞系的建立，为进一步研究人Syncytin功能及其与白血病免疫逃逸的关系提供了重要的细胞模型和实验基础。

关键词：Syncytin蛋白；pIRES2-EGFP质粒；真核表达载体；EL4细胞；白血病

中图分类号：Q786

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）03-0205-06

人内源性逆转录病毒（human endogenousretrovlruses，HERV）是几百万年前整合到人类基因组中，并以孟德尔方式遗传至今的逆转录病毒的残余物，约占人类基因组DNA的8%[1]。大多数HERVs在进化过程中由于突变、缺失等的积累失去了编码能力[2，3]，但仍有少数HERVs的开放阅读框（open reading frames，ORFs）被完整保留了下来。这些完整的ORFs可以编码逆转录病毒的蛋白，在一些特定的组织或分化发育的特定阶段表达，可能具有重要的生理意义。Syncytin是HERVs-W家族的囊膜蛋白，主要在胎盘中表达，介导合胞滋养层的形成，维持胎盘正常的生理功能[4]。HERVs已被证实与肿瘤形成密切相关，如乳腺癌[5]、慢性骨髓瘤白血病[6，7]，研究发现syncytinmRNA和Syncytin在9种白血病或淋巴瘤细胞系中均有表达[8]，具有潜在的研究价值。

Syncytin的373-397残基是一个具有免疫抑制活性的多肽[9]，其在细胞表面的大量表达有利于癌变细胞逃避免疫打击，同时其具有的融合活性有利于细胞的迁移[10]。本研究拟构建syncytin，真核表达载体，并通过罗氏转染试剂转染小鼠淋巴瘤细胞细胞株（EL4），并通过G418抗性培养基筛选出稳定表达Syncytin的细胞系，通过RT-PCR和Western blot分别从mRNA与蛋白水平验证syncytin在EL4细胞中的表达情况。稳定表达syncytin基因的EL4细胞系的建立为进一步探讨syncytin基因异常表达对白血病免疫逃逸的机制提供细胞模型和实验基础。

1材料和方法

1.1材料

PIRES2-EGFP质粒、C8166细胞由本实验室保存，E.coli DH5α感受态细胞、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，Marker 2500购自天根生物技术公司；EL4细胞购自上海细胞库；DNA Marker、限制性内切酶（EcoR I、BamH I）、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、SYBR MASTER Mixture、Trizol试剂均购于日本Takara公司；X-tremeGENE HPDNA Transfection Reagent购自罗氏公司；PCR引物及RT-PCR引物由华大基因合成；RPMI1640液体培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；Trizol、Opti-MEM均购于美国Invitrogen公司；Syncytin（H-280）抗体购自美国SANTA公司；Real time PCR仪（日本TAKARA公司）；凝胶成像仪（天能公司）摄像分析，Nanodrop分光光度仪（美国Thermo公司），荧光显微镜（H本Olympus公司），CO2培养箱（日本三洋），其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2pIRES2-syncytin-EGFP重组质粒的构建及鉴定

根据GenBank中的人syncytin基因编码区序列（核苷酸库中的编号：AF072506.2）设计了两套引物，引物（s-1，s-2）和内围引物（S，A），内围引物中在上游引物5'端引入EcoR I酶切位点，下游引物5'端引入BamH I酶切位点。S-l：5'-AGGACCCTACCCAGTCATTTTATCT-3'、S-2：5'-GAAGACTTGGGTTTATATCCCGATC-3，：S：5'-CG-GAATTCATGGCCCTCCCTTATCAT-3'、A：5'-CGGGATCCCTAACTGCTTCCTGCTG-3'。培养C8166细胞并提取细胞总RNA，以其为模板利用一步法逆转录试剂盒扩增，反应参数为：94℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 1min 30s，共40个循环；以扩增产物为模板，用高保真DNA聚合酶PirmeSTARMAX进行PCR扩增带有酶切位点的目的片段syncytin，扩增片段大小为1.6kb。PCR反应参数为：94℃ 10s、62℃ 5s、72℃ 10s，共35个循环。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，用EcoR I/BamH I双切后纯化回收，随后用T4 DNA连接酶将其与EcoR I /Bam，H I双切后电泳凝胶回收的PIRES2-EGFP线性质粒进行16℃过夜连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，接种至含卡那霉素（Kan+）的LB琼脂糖培养板上培养，挑取单菌落接种于LB培养基（含Kan+）中，37℃振摇过夜。用质粒小量提取试剂盒重组质粒，分别进行PCR及EcoR I/BamH I限制性内切酶双切后电泳鉴定，阳性质粒送样测序后经DNA序列分析验证。构建的重组质粒命名为pIRES2-syncytin-EGFP。

1.3稳定表达Syncytin的EL4细胞系的建立

1.3.1EL4细胞的培养和质粒转染

ELA细胞在含10%胎牛血清的1640培养基中，于37℃、5% CO2条件下培养。参照罗氏转染试剂盒说明书分别完成重组载体pIRES2 -syn-cytin-EGFP和空载体pIRES2-EGFP的转染。1）转染前4h，将处于对数生长期的EIA细胞以lx105密度铺于24孔板，使细胞汇合度至80%～90%；2）转染前用无血清无双抗1640洗涤细胞；3）50μL OPTI-MEM分别稀释0.5μg DNA，室温孵育5min；4）50μL OPTI-MEM分别稀释1.5μL X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，室温孵育5min；5）将3）、4）中的液体混合，室温孵育15～20min；6）将转染复合物逐滴加入细胞孔板中，轻柔震荡混匀，放人37℃、5% CO2培养箱培养；7）转染48h后荧光显微镜下观察荧光。

1.3.2稳定表达Syncytin的EL4细胞系的获得

将对数生长期的EL4细胞接种于24孔板，每孔5000个，分别加入0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、l 10022、1200mg/L的G418，3d换一次含有相同浓度的培养液，筛选14d，以细胞全部死亡的最低G418质量浓度为最佳筛选剂量。重组质粒pIRES2-syncytin-FGFP转入EI4细胞48h后，进行细胞传代，并更换含有G418的l640培养液进行筛选，每隔3d更换培养液1次。2周后对筛选的细胞进行有限稀释法挑选细胞，铺96孔板，挑出单个细胞并扩大培养，最终获得具有G418抗性的稳定表达syncytin的EL4细胞系，命名为ELA-Syncytin细胞和空载体质粒稳定转染细胞。

1.4RT-PCR检测syncytin转录水平的表达

收集EL4-Syncytin细胞和空载体质粒稳定转染的细胞，按Trizol试剂说明书抽提细胞总RNA，反转录制备cDNA，进行PCR反应。利用Prime5.0软件设计syncytin，上下游引物，上游引物5'-ATCCCCCGCAACTGCTATC-3'，下游引物5'-AGACAGTGACTCCAAGTCCTC-3'，扩增产物大小为112bp。内参基因GAPDH上游引物5'-GGTGAAGCJTCGGTGTGAACG-3'，下游引物5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'，扩增产物大小为233bp。扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s；55℃退火15s；72℃延伸20s，共30个循环；72℃继续延伸5min。对实验数据进行统计学分析。

1.5Western印记检测细胞中Syncytin蛋白的表达

收集EL4-Syncytin细胞和空载体质粒稳定转染的细胞，用含蛋白酶抑制剂的单去污裂解液裂解细胞，冰上放置5min，超声充分碎裂，4℃，12000r/min离心10min，收集上清，即为细胞总蛋白。用BCA进行蛋白定量，再加入5xloadingbuffer混匀后煮沸5min，离心后-80℃冻存备用。各取20μL蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电转使蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温震荡封闭2h，与兔抗人Syncytin抗体（美国Santa公司）孵育过夜，用TBST洗PVDF膜3次，每次5min；再与HRP标记的山羊抗兔的抗体室温孵育2h，TBST洗PVDF膜3次，每次5min，化学发光剂显影并保存图像。

2结果与分析

2.1syncytin基因ORF的扩增

以C8166细胞总RNA为模板进行逆转录PCR扩增产物为模板扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，所得PCR产物片段约为1621bp，与预期的syncytin基因ORF长度一致（图1）。表明syncytin，基因ORF被成功克隆。

2.2重组质粒的鉴定

pIRES2-syncytin-EGFP重组质粒与空载体分别EcoR I /BamH I双切后进行1%琼脂糖凝胶电泳，可约见1.6kb与5.3kb大小片段，与预计大小相符（图2）。DNA测序结果显示与人的syncytin ORF序列一致。可表达syncytin基因的真核表达载体构建成功。

2.3稳定表达Syncytin的EL4细胞系的鉴定

2.3.1pIRES2-syncytin-EGFP非融合绿色荧光蛋白的表达

在EL4-Syncytin细胞中，可清楚地观察到荧光蛋白（图3A、B、C、D），表明所构建的重组synctin载体已在EL4细胞表达。

2.3.2RT-PCR检测syncytin，基因的表达

提取EL4-Syncytin细胞和空载体转染细胞总RNA，以小鼠GAPDH基因为内参，运用qRT-PCR对syncytin进行相对定量。每个实验组两个复孔，实验重复3次。通过各组样品Ct值，利用2-Ct法计算得出EL4-Syncytin组为空载体对照组的120倍，表明syncytin在EL4细胞稳定高表达。实验结果见图4（A、B、C、D）。

2.3.3Western印记检测人Syncytin表达

EL4-Syncytin细胞和空载体质粒稳定转染细胞所提总蛋白经Western印记检测，内参显影条带亮度一致，EL4-Syncytin组条带亮度明显高于对照组，通过灰度值计算软件处理计算出实验组与对照组数据（见图5、6），EL4-Syncytin组蛋白表达水平明显高于空载体组蛋白表达水平，表明Syncytin在EL4细胞稳定表达且高表达。

3讨论

肿瘤对人类的生命和健康造成了极大的威胁。以白血病为例，白血病是国内10个高发的恶性肿瘤之一，是35岁以下人群发病率的死亡率最高的恶性肿瘤。白血病的病因与发病机制非常复杂，目前还未完全清楚，病毒因素、遗传因素、染色体及免疫功能遗传都与白血病发病有关。由于对大多数白血病发病的病因、病理机制缺乏系统深入研究，致使临床上多数患者得不到早期诊断和规范治疗，疗效和预后较差。尽管目前已发现多个基因与肿瘤发生有关，但是能真正用于白血病诊断及治疗的基因为数不多。寻找与白血病相关的基因，研究它们在白血病发生和发展中的作用机制，对白血病的早期诊断和治疗具有重要意义。

人类内源性病毒（HERV）是远古逆转录病毒感染人类基因组后留下的遗迹。其组成约占人类基因组3%～8%。目前，可分为至少31个家族[1，2]。由于基因突变的原因，大多数人类内源性病毒基因已失去转录活性[3]。只要少数的基因保留了完整的开放读码框。多项研究表明，人类内源性病毒基因的异常表达与肿瘤形成密切相关。Syncytin是HERVs-W家族的囊膜蛋白，主要在胎盘中表达，介导合胞滋养层的形成，维持胎盘正常的生理功能[4]。本研究小组在最近的研究中，偶然发现syn-cytin， mRNA和Syncytin蛋白在9个白血病或淋巴瘤细胞系中均有不同程度的表达，而且syncytin基因的表达水平与白血病患者病情相关。通过对Syncytin的结构分析发现，Syncytin内存在一个具有免疫抑制活性的肽段，其373～397残基是一个具有免疫抑制活性的多肽，其在细胞表面的大量表达利于癌变细胞逃避免疫打击，同时其具有的融合活性有利于细胞的迁移。目前未见到syncytin（mRNA及蛋白）与血液系统肿瘤的文献报道，此基因与白血病的相关性为我们首次发现并已获得专利。syncytin是怎样参与白血病肿瘤细胞免疫逃逸机制并发挥作用目前仍待进一步研究。

本研究以C8166细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增获得syncytin的cDNA全长，并成功将其克隆到pIRES2-EGFP载体CMV启动子下游，从而成功构建了可在真核细胞中表达Syn-cytin蛋白的pIRES2-syncytin-EGFP表达载体。将该载体转染至EL4细胞，并通过筛选建立了人syncytin基因稳定表达的EL4细胞系。以空载体质粒稳定转染EL4细胞为对照，用RT-PCR和Western印记分别从mRNA和蛋白水平检测了Syncytin的表达。结果显示，syncytin基因能有效地在EL4细胞转录和翻译，表明成功建立了稳定表达人Syncytin的EL4细胞系。该真核表达载体的构建和稳定表达细胞系的建立，为syncytin在白血病肿瘤中的作用和其免疫逃逸机制的研究提供了必要的细胞模型，为后续功能实验奠定了基础。

参考文献（ References）：

[1]BELSHAW R.KATZOURAKIS A，PACES J， et al.High copynumher in human endogenous retrovirus families is associatedwith copying mechanisms in addition to reinfection[J]. Molec-ular Biology and Evolution， 2005， 22（4）：814-817.

[2]LOWER S，LOWER J，KURTH R.The viruses in all of us：characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences[J]. Proceedings of the National Acade-my of Sciences， 1996， 93（11）：5177-5184.

[3]BANNERT N.KURTH R Retroelements and the humangenome： new perspectives on an old relation[J]. Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States ofAmerica， 2004， 101：14572-14579.

[4]HARRIS J R.Placental endogenous retrovirus（ERV）： structural，functional， and evolutionary significance[J]. BioEssays： News andReviews in Molecular， Cellular and Developmental Biology，1998， 20（4）：307-316.

[5]LARSSON L.HOLCK S，CHRISTENSEN J Prognostic role ofsyncytin expression in breast cancer[J]. Human Pathology， 2007，38（5）：726-731.

[6]BRODSKY I.FOLEY B，HAINES D，et al.Expression ofHERV-K provirus in human leukocytes[J]. Blood， 1993， 81（9）：2369-2374.

[7]DEPIL S，ROCHE C，DUSSART P.et al.Expression of a hu-man endogenous retrovirus， HERV-K， in the blood cells ofleukemia patients[J]. Leukemia， 2002，16（2）：254-259.

[8]SUN Y， OUYANG D Y.PANG W，et al.Expression of syncytin inleukemia and lymphoma cells[J]. Leukemia Research， 2010， 34（9）：1195-1202.

[9]Ml S，LEE X，LI X，et al.Syncytin is a captive retroviral en-velope protein involved in human placental morphogenesis[J].Nature， 2000， 403（6771）：785-789.

[10]BLOND J L，LAVILLETTE D，CHEYNETNV，et al.An enve-lope glycoprotein of human endogenous retrovirus HERV-W isexpressed in the human placenta and fuses cells expressingthe type D mammalian retrovirus receptor[J]. Journal of Virol-ogy， 2000， 74（7）：3321-3329.