炮制前后莶草指标性成分及指纹图谱研究

[摘要] 该文通过研究莶草生品及炮制一至九制品中奇壬醇、莶精醇和莶苷含量变化规律及指纹图谱对比，为莶草炮制研究提供实验基础。采用SunFire-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温30 ℃，流动相乙腈（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸），流速1 mL・min-1，进样量30 μL，检测波长215，320 nm，奇壬醇在2.180～26.16 mg・L-1呈良好的线性关系，平均加样回收率为96.4%，RSD 2.2%；莶精醇在2.900～34.80 mg・L-1呈良好的线性关系，平均加样回收率为97.2%，RSD 1.7%；莶苷在1.012～6.072 mg・L-1呈良好的线性关系，平均加样回收率为96.3%，RSD 2.4%。该方法准确可靠，重复性好，快速简便；实验结果为莶草炮制过程中化学成分变化规律和进一步阐明其疗效的改变奠定了基础。

[关键词] 莶草；奇壬醇；莶精醇；莶苷；中药炮制

[收稿日期] 2014-06-09

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81173550）

[通信作者] 马长华，研究方向为中药质量控制，Tel：（010）84738603，E-mail：

[作者简介] 孔繁瑶，E-mail：

莶草为较常用中药，始载于唐代《新修本草》。《中国药典》2010年版收载菊科植物莶Siegesbeckia orientalis L.、腺梗S. pubescens M.和毛梗莶S. glabrescens M. 3种植物的地上部位作为中药莶草[1]，主产于秦岭及江南各地。莶草性味辛、苦、寒，归肝、肾经。莶草具有祛风湿、利关节、解毒之功效，可以治疗风湿痹痛、筋骨无力、腰膝酸软、四肢麻痹、半身不遂、风疹湿疮[2]。

炮制过程对某些中药的影响非常显著，药材的药性可以发生变化[3-4]；一些中药药材能够通过炮制的方法来使得本身的毒性或者不良反应有所下降[5]。中药炮制工艺作为我国医药学中一门传统的技术学科，对促进临床用药安全具有重要作用[6]。炮制莶草，其药性药效发生改变，本实验对《证类本草》中莶草炮制方法进行研究，莶草经过蜂蜜黄酒的九蒸九制[7]，化学成分及药性发生了巨大变化，能够有效治疗中风后遗症，有重要意义。

1 材料

岛津LC20A高效液相色谱仪（DGU-20A5脱气机，LC-20AT高效泵，SPD-20A检测器，SIL-20A自动进样器，CTO-10ASvp柱温箱，LCsolution工作站）；BL-100型高速多功能粉碎机，KQ-300DB型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器厂）；HH-4数显恒温水浴锅（金坛市化降仪器有限公司）；溶剂过滤器（津腾公司）；0.22 μm微孔滤膜（拜耳迪公司）；1 mL一次性无菌注射器（拜耳迪公司）；METTLER AE240型 1/1万天平，Sartorius BT 25S型1/10万电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

乙腈为色谱纯（Fisher试剂），水为纯净水（哇哈哈纯净水），甲酸（分析纯，北京化工厂），对照品奇壬醇（上海顺勃生物工程有限公司，批号201209，纯度≥98%），莶精醇（上海顺勃生物工程有限，公司批号201208，纯度≥98%），莶苷（上海顺勃生物工程有限公司，批号201206，纯度≥98%），炮制工艺中黄酒为上海金枫酒业黄酒，蜂蜜为北京百花蜂蜜公司洋槐蜂蜜，水为超纯水。

莶草药材购于北京同仁堂药房（批号20121009），并由北京中医药大学胡慧华副教授鉴定，依照2010年版药典收录的莶草项下薄层色谱检查方法进行检验，为S. pubescens腺梗莶的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 炮制方法

取75 g蜂蜜及75 g黄酒加适量水拌匀，分成9份。莶草150 g，加蜂蜜黄酒辅料1份，拌匀，隔水蒸45 min，取出，阴干，再拌匀1份辅料，蒸45 min，阴干，如此9次。莶草炮制品为实验室自制。

2.2 色谱条件

SunFire-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相乙腈（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸），有机相梯度为0～12 min，10%～20%；12～17 min，20%～25%；17～60 min，25%～45%；60～90 min，45%～90%；90～100 min，90%。柱温30 ℃，流速1 mL・min-1，进样量30 μL，奇壬醇、莶精醇检测波长为215 nm，莶苷检测波长为320 nm。指纹图谱测定检测波长为215 nm。

2.3 对照品溶液的制备

分别取奇壬醇、莶精醇、莶苷对照品约10，14，5 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成0.436 0，0.580 4，0.202 4 g・L-1的溶液，作为奇壬醇、莶精醇、莶苷对照品溶液。

2.4 供试品的制备

取莶草样品，粉碎，过50目筛；取莶草粉末2 g，精密称定，精密加入10 mL甲醇，称定；75 ℃恒温水浴回流提取5 h，放冷，甲醇补足失重，摇匀，过滤，取续滤液即得[2]。

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线的绘制 分别取奇壬醇对照品溶液5，10，30，40，50，60 μL，注入液相色谱仪，按2.2项下方法进行分析，记录色谱峰面积。以峰面积（Y）对对照品进样量（X）进行线性回归，得奇壬醇回归方程为Y=590 874X-34 611，R2+=0.999 6；线性范围2.180～26.16 μg。

分别取莶精醇对照品溶液5，10，30，40，50，60 μL，注入液相色谱仪，按2.2项下方法进行分析，记录色谱峰面积。以峰面积（Y）对对照品进样量（X）进行线性回归，得莶精醇回归方程为Y=571 310X+73 208，R2+=0.999 8，线性范围2.900～34.80 μg。

分别取莶苷对照品溶液5，10，15，20，25，30 μL，注入液相色谱仪，按2.2项下方法进行分析，记录色谱峰面积。以峰面积（Y）对对照品进样量（X）进行线性回归，得莶苷回归方程为Y=293 024X+5 469，R2+=0.999 8，线性范围1.012～6.072 μg。

2.5.2 精密度试验 分别取2.3项下配制的奇壬醇、莶精醇和莶苷对照品溶液，按2.2项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果显示，3个成分的保留时间RSD分别为0.10%，0.05%，0.18%，峰面积RSD分别为0.16%，0.33%，0.25%，均小于3%，表明方法精密度良好。

取莶草生品供试品溶液，在上述色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果显示，7个特征峰保留时间RSD分别为0.55%，0.38%，0.27%，0.21%，0.18%，0.22%，0.11%；峰面积RSD分别为1.9%，1.6%，2.8%，1.9%，2.3%，1.7%，1.6%，保留时间RSD均小于3%，峰面积RSD均小于3%，表明方法精密度良好。

2.5.3 重复性试验 取莶草生品6份，分别制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样，记录色谱图。结果显示，奇任醇、莶精醇和莶苷3个成分保留时间RSD分别为0.050%，0.040%，0.12%，峰面积RSD分别为1.8%，1.1%，1.3%， 保留时间RSD均小于3%，峰面积RSD均小于3%，表明方法重复性良好。

取莶草生品6份，分别制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样，记录色谱图。结果显示，7个特征峰保留时间RSD分别为0.37%，0.23%，0.18%，0.090%，0.21%，0.15%，0.11%；峰面积RSD分别为1.3%，2.7%，2.8%，1.9%，2.6%，1.1%，2.5%，保留时间RSD均小于3%，峰面积RSD小于3%，表明方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 取莶草生品供试品溶液，按2.2项下色谱条件，分别于0，3，6，9，12，15，18，21，24 h进样，记录色谱图。计算奇壬醇、莶精醇和莶苷保留时间RSD分别为0.15%，0.67%，0.16%，含量的RSD分别为1.0%，1.9%，1.3%，说明供试品溶液中3个成分在24 h内稳定。

计算各特征峰的保留时间RSD分别为0.57%，0.28%，0.23%，0.22%，0.27%，0.040%，0.020%，峰面积RSD分别为1.8%，2.2%，1.4%，2.2%，2.1%，1.4%，2.4%，RSD均小于3%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.5 加样回收率试验 取6份已知含量的莶草生品约1 g，精密称定，同时加入质量浓度为4.013 2 g・L-1的奇壬醇对照品溶液1 mL，同2.4项下方法处理。按2.2项下条件进行测定，计算加样回收率。结果奇壬醇的平均回收率为96.4%，RSD 2.2%（n=6）。

取6份已知含量的莶草生品约1 g，精密称定，同时加入质量浓度为0.088 2 g・L-1的莶精醇标准品溶液1 mL，同2.4项下方法处理。按2.2项下条件进行测定，计算加样回收率。结果莶精醇的平均回收率为97.2%，RSD 1.7%。

取6份已知含量的莶草生品约1 g，精密称定，同时加入质量浓度为0.580 2 g・L-1的莶苷对照品溶液1 mL，同2.4项下方法处理。按2.2项下条件进行测定，计算加样回收率。结果莶苷的平均回收率为96.3%，RSD 2.4%。

2.6 样品测定

取莶草生品及1～9次炮制品，按2.4项下方法制备供试品溶液，精密吸取30 μL，注入高效液相色谱仪，按2.2项下条件测定，采用回归方程计算含量。结果见图1，表1。

将莶草生品及1～9次炮制品中奇壬醇、莶苷以及莶精醇的含量变化做成趋势图见图2。可以看出莶草中奇壬醇的含量有非常明显的降低，其中在第1次炮制与第9次炮制之后的下降趋势最为明显；莶苷的含量变化尤为特别，在前3次炮制之后含量有明显升高，而在第9次炮制之后又有明显的下降，但在总体含量变化来看，莶苷的含量是有所提高的；莶精醇只存在于莶草生品中，在1～9次炮制品种并未检测到莶精醇。

2.7 指纹图谱

取莶草供试品溶液。按2.2项下测定，指纹图谱见图3，相似度分析见表2。

由生品及1～9次炮制品HPLC结果图中可看出，莶草在炮制过程中，在215 nm可检测出的化学成分种类明显减少，大部分成分含量明显降低。

由于炮制过程中莶草生品以及每一次炮制品的化学成分及含量差异较大，所以指纹图谱差异较大，相似度不高。从而在物质基础上印证了莶草炮制前后疗效差异大。

3 讨论

含量测定结果表明所建立的各含量测定方法操作简便、精密度和重复性良好，回收率合格，测定结果准确，可以用于莶草生品及1～9次炮制品奇壬醇、莶苷、莶精醇成分含量测定。最后得出，随着炮制次数的增加，莶草中化学成分的种类和含量是逐渐减少的。一部分化学成分在第1次炮制之后就已经完全消失，比如指标性成分莶精醇；其中大部分化学成分的含量是明显降低的，比如指标性成分奇壬醇；在整体降低的趋势当中，可以找到某些化学成分的含量有略微升高，比如指标性成分莶苷，在前8次的炮制过程中，莶苷的含量有明显的上升趋势，当炮制到第9次后，莶苷的含量又明显降低，而总体含量略微升高。最后通过对奇壬醇、莶精醇以及莶苷的含量测定，进一步量化了莶草在炮制过程中指标性成分的含量变化。这一试验可以为研究莶草炮制前后的药性、药效不同做理论依据。

[参考文献]

[1] 张哲峰，杨连荣，李彦冰，等.莶草化学成分与药理活性的研究进展[J]. 中医药信息，2006，23（3）：15.

[2] 中国药典. 一部[S]. 2010：255.

[3] 高飞，傅超美，胡慧玲，等. 关于中药炮制机制研究现状与发展趋势的思考[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（5）：352.

[4] 李飞.对中药炮制现状及其研究方向的思考[C]. 北京：中华中医药学会第三届中药炮制分会学术会议，2003.

[5] 杨勇兵.炮制对中药成分及疗效的影响[J].临床合理用药，2013，6（11C）：143.

[6] 张建，臧传军，裴慧，等.中药炮制工艺存在的问题文献分析与对策[J].中国药房，2013，24（39）：3742.

[7] 唐慎微.证类本草[M].北京：华夏出版社，1993.

Study on index components and fingerprints of crude

and processed Siegesbeckia Herbs

KONG Fan-yao， HU Hui-hua， TIAN Zhi-hao， XU Wen-ying， FENG Meng-xin， MA Chang-hua

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] The change of kirenol， darutigenol and darutoside in Siegesbeckia and its first to ninth processed products were studied， and the ten fingerprints were compared， which provided the experimental basis for the study of Siegesbeckia processing technology. The samples were analysed by HPLC on a SunFire-C18 column （4.6 mm× 150 mm， 5 μm） with gradient elution of acetonitrile （0.1% formic acid）-water （0.1% formic acid） at a flow rate of 1.0 mL・min-1. Column temperature was 30 ℃ and the detected wavelength was 215， 320 nm. The calibration curves of kirenol， darutigenol and darutoside were linear in the range of 2.180-26.16， 2.900-34.80， and 1.012-6.072 mg・L-1， respectively， and the average recoveries were 96.4%， 97.2% and 96.3% wit RSD 2.2%， 1.7% and 2.4%. This method was simple， the result was stable and had good repeatability， recovery and precision. The result was the basis of the chemical contents variation in the processing of Siegesbeckia Herbs and further clarifying the effect of the changing.

[Key words] Siegesbeckia Herbs；darutigenol； darutoside； kirenol； preparation

doi：10.4268/cjcmm20141521