除脂生发片中有效成分2,3,5,4′―四羟基二苯乙烯苷的高效液相色谱法含量测定

［摘要］中成药中采用高效液相色谱法测定2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷的含量已经有文献报道，本文参考养血生发胶囊[1]和防脱生发灵洗液质量标准[2]及中国药典何首乌项下[3]等质量标准，采用高效液相色谱法测定制剂中所含2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷的含量，该法灵敏度高、专属性好、操作简便、重现性好，为除脂生发片的质量评价提供可靠的检测手段。

[关键词]除脂生发片、高效液相、2,3,5,4′―四羟基二苯乙烯苷、含量测定

1 仪器与试药

高效液相色谱仪：LC-10AD(Shimadzu)型泵；SPD-M10AVP-DAD检测器；CLASS-VP色谱工作站。

试剂与试药：2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷对照品（批号0844-200003，供含量测定用, 中国药品生物制品检定所提供）。

乙腈为色谱纯，水为超纯水。

除脂生发片由北京章光101药业有限公司提供。批号：031110，031113，031116。

2 色谱条件和检测波长

色谱柱：Phenomenex Kromasil 100A （250×4.6mm，5μm）分析柱；流动相：乙腈水（2080）；检测波长：320nm；流速：1.0ml/min；柱温：40℃。

用二极管阵列检测器分析比较了2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷对照品色谱峰和样品中所测成分相应色谱峰的紫外扫描光谱，结果紫外光谱基本一致，均在320nm处有一最大吸收峰，故确定检测波长为320nm。

3 含量测定方法

照高效液相色谱法（中国药典2000年版一部附录VI D）测定。

4 试验可行性考察

4.1对照品纯度检查精密吸取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，纯度为100%。

4.2系统适用性试验精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，理论板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷峰计为9690.84。

4.3空白试验空白溶液的制备是按处方中药味的比例自配缺何首乌药材的群药，按其工艺制成空白制剂，再按照上文含量测定项下方法进行测定，比较了供试品溶液、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷对照品溶液、空白溶液的色谱图，结果在上述色谱条件下，供试液中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷峰与其它组分色谱峰能达到基线分离，空白对照液中色谱峰对测定无干扰。

5 对照品溶液的制备

精密称取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷对照品6.48mg，置50ml量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷0.1296mg）。

6 供试品溶液的制备方法考察

6.1提取溶剂的选择取同一批号的样品适量，加入不同溶剂，（甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇、水）分别加热回流1小时，按照上文含量测定方法进行测定，结果得出采用50%乙醇为溶剂提取较完全。

6.2提取方法的选择取同一批号的样品适量，采用50%乙醇考察了回流提取及超声提取两种方法。实验结果表明，热回流略高于超声处理，但二者相对偏差仅为1.90%，因此采用较为简便的超声处理提取方法。

6.3提取时间的选择取同一批号的样品适量，用50%乙醇溶液，超声处理15、30、45分钟，按上文方法测定，根据结果，选择超声处理30分钟作为提取方法即可。

制备方法:取本品20片，除去糖衣，研细，取0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷至室温，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，取上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取滤液，即得。

7 线性关系的考察

精密吸取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷对照品溶液（0.1296mg/ml），分别进样0.5、1 、3、5、7、9、12、18、30μl，注入液相色谱仪，按上文所述色谱条件测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程：

Y=3E+06X-10903,R2=1

结果表明：2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷在0.0648~3.8880μg范围内有良好的线性关系。

8 精密度试验

精密吸取浓度为0.1296mg/ml 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷对照品溶液5μl，重复进样5次，按上文所述色谱条件测定，峰面积积分值的相对标准偏差为0.51%，符合要求。

9 样品溶液稳定性试验

精密称取供试品0.6001g，照上文所述方法制备供试品溶液，精密吸取10μl, 每间隔一定时间进样，测定，平均峰面积为606204.6，相对标准偏差为0.71%。结果表明，供试品溶液在3日内基本稳定，本方法有良好的稳定性。

10 重现性试验

取同一批号的除脂生发片5份，按上文含量测定方法，平行试验，测定，平均片重为0.3121g，结果见表1。

11 加样回收率试验

取已知含量的同一批号样品（031110，含量为0.9759mg/g）约0. 3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷对照品溶液（0.01176mg/ml）各25ml，按上文供试品溶液的制备方法制备供试液，平行试验5份，按上文色谱条件，测定其含量，按下式计算回收率：

结果平均回收率为100.14，相对标准偏差为1.15，表明本方法具有良好的回收率。

12 样品测定

本品3批，按上文所述方法测定，计算2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯苷的含量，平均含量（/mg/片）为0.3013，相对标准偏差为0.97，符合要求。

13 讨论与小结

13.1供试品制备方法选择的正确与否直接影响检测结果的准确性，本方法通过对供试品提取溶剂的选择、提取方法、提取时间等多项因素进行了考察，从而得出对于本供试品较为恰当的制备方法。

13.2方法验证表明，本方法的稳定性、加样回收率和重现性均能满足定量要求，同时操作比较方便，在实际生产中是检测本产品含量的良好方法。

参考文献

1. 蒋琴，鞠建明，鲁静。养血生发胶囊中何首乌羟芪衍生物的

含量测定.时珍国医国药，2001，12（9）：786.

2. 周涛，江维克。防脱生发灵洗液质量标准研究.中成药，2002，

24（12）：929.

3. 《中国药典》2000年版一部，化学工业出版社，139.

编注：除脂生发片是北京章光101药业有限公司新生产的品种，为《中华人民共和国卫生部药品标准》（中药成方制剂）第十册收载品种。除脂生发片处方由当归、牡丹皮、川芎、制何首乌、白鲜皮、防风、荆芥、地黄、地肤子、蝉蜕、苦参、蜈蚣、僵蚕等13味药组成。具有滋阴，养血，祛风，活络，止痒，除油脂的作用。用于脂溢性脱发，头皮瘙痒，落屑，油脂分泌过多症，有较好的治疗效果。