利用体内电脉冲增强治疗型HBV DNA疫苗细胞免疫反应的研究

[摘要] 目的:研究在初次免疫和加强免疫阶段分别使用不同的免疫模式能否增强HBV DNA疫苗的细胞免疫反应。方法:肌内注射10 μg HBV DNA疫苗的Balb/c小鼠根据电脉冲实施时间的不同选择两种免疫模式,DNA+EP或EP+3 d+DNA,按在初次免疫和加强免疫阶段免疫模式的不同组合次序进行分组。各组小鼠在实施加强免疫后第14天取脾细胞做抗原特异的IFN-γ ELISPOT检测和FACS分析。结果:在初次免疫和加强免疫阶段使用不同免疫模式的实验组与采用相同免疫模式的实验组相比,诱导的特异性IFN-γ T细胞频数和IFN-γ的CD8+ T细胞百分比均增加了4倍以上,差异有高度统计学意义(P0.05)。结论:在初次免疫和加强免疫阶段利用体内电脉冲实施不同的免疫模式能显著增强HBV DNA疫苗在动物体内的细胞免疫效果。

[关键词] HBV DNA疫苗;体内电脉冲;初次免疫-加强免疫策略;细胞免疫反应

[中图分类号] R392[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)04(b)-023-04

Alternating immune modes utilizing electric pulses in vivo enhance cellular immune responses induced by therapeutic HBV DNA vaccine

QIU Ligong, SUN Xihai, WEI Jian, ZHAO Liang, HUANG Ming

(Baidi Bio-Pharmaceutical R&D Center, Guangzhou Pharmaceutical Holdings Limited, Guangzhou 511495, China)

[Abstract] Objective: To investigate the possibility of improving cellular immune responses induced by HBV DNA vaccine by alternating immune modes in prime-boost regimen. Methods: Balb/c mice to be vaccinated with 10 μg HBV DNA vaccine were divided according to the order of immune modes which could be chosen between two alternative immune modes (DNA+EP or EP+3 d+DNA) and could be same or alternating in prime-boost regimen. The splenocytes from mice of all groups were detected by antigen-specific IFN-γ ELISPOT and FACS assays at the 14 th day after boost. Results: The numbers of antigen-specific IFN-γ secreting T cell or CD8+ T percentage from groups of alternating immune modes were 4 times higher than those of the same immune modes (P0.05). Conclusion: Alternating immune modes in prime-boost regimen utilizing electric pulses can induce high levels of cellular immune responses.

[Key words] HBV DNA vaccine; Electric pulses in vivo; Prime-boost strategy; Cellular immune responses

近年来,以质粒DNA为基础的免疫方法广泛应用于疾病预防和治疗研究中,显示了巨大的治疗潜力。为了提高质粒DNA的免疫原性和免疫效果,学者们进行了各种方法和策略的研究,其中以电脉冲(electric pulse,EP)介导的DNA疫苗免疫方法在激发高水平免疫反应方面具有突出的效果。EP能增强DNA疫苗的免疫应答,其效应不受实验动物种属的限制[1-2]。现有的研究和临床方案中普遍采用肌注质粒DNA后立即使用体内电脉冲的模式(DNA+EP模式),主要是利用电脉冲促进外源DNA的转染效果,从而达到增强免疫反应的效果。最近,Peng等[3]在研究中率先采用了一种全新的免疫模式:在肌肉部位预先实施体内电脉冲,几天后于原位免疫注射DNA疫苗,即EP+n d+DNA模式。研究结果表明,注射前进行电脉冲的模式下质粒的转染率和表达量较低,但这种模式和DNA+EP模式一样能产生相近滴度的IgG抗体。实验数据表明,在EP+n d+DNA模式中抗原递呈细胞直接转染、表达外源基因成为加强肌注DNA疫苗免疫反应的主要因素。

Peng等[3]证明EP+n d+DNA免疫模式主要是通过直接递呈(direct presentation)的机制诱导免疫反应,但对DNA+EP模式的主要抗原递呈机制还不清楚。另外,这两种利用电脉冲的免疫模式之间是否存在协同作用尚需进一步研究。本实验以Balb/c小鼠为实验动物模型,研究在不同的电脉冲模式下使用初次免疫结合加强免疫(prime-boost)策略增强治疗型乙型肝炎病毒(hbv)dna疫苗的免疫效果,发现在prime和boost阶段分别使用不同的电脉冲联合疫苗注射免疫模式能激发更强的细胞免疫效果。现将研究结果报道如下:

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

Balb/c小鼠,雌性,6～8周龄,SPF级,购自广东省医学实验动物中心。

1.1.2 试剂及仪器

1.1.2.1 主要试剂真核表达质粒pcDNAS2S,编码HBV表面抗原preS2S,广州拜迪生物医药有限公司制备;HBV特异性抗原多肽,为编码HBV表面抗原preS2S中的一段多肽序列:LLTRILTIPQSLDSWWTSLN,第四五八医院肝病研究所惠赠;酶联斑点免疫检测(ELISPOT)试剂盒、单克隆抗体CD8FITC、IFN-γ PE、CD4 PerCP以及相应标记的同型对照、蛋白转运抑制剂BFA、Anti-mouse CD28抗体均为美国BD产品;佛波二脂(PMA)、Ionomycin、固定剂多聚甲醛和穿透剂Saponin均为Sigma公司产品;RPMI 1640培养基为Gibco公司产品;胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品;淋巴细胞分离液为达科为生物技术有限公司产品。

1.1.2.2 主要仪器BD FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品;CO2培养箱为Precision Scientific产品;96孔Minipore multiscreen板为美国BD公司产品;电脉冲药物导入仪(TERESA-EPTⅠ型)购自上海塔瑞莎健康科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组和免疫模式

清洁级Balb/c小鼠,随机分为6组(8只/组)。每只小鼠免疫注射pcDNAS2S,每次剂量为10 μg/只,注射部位为双侧胫前肌(TA)。Ⅰ组免疫模式:prime阶段,在待免疫注射部位实施EP,3 d后免疫注射;EP后第42天按同样方式在同一免疫注射部位开始实施boost。Ⅱ组免疫模式:prime阶段,免疫注射后立即实施EP;免疫注射后第42天按同样方式在同一免疫注射部位实施boost。Ⅲ组免疫模式:prime阶段,在待免疫注射部位实施EP,3 d后免疫注射;免疫注射后第42天开始实施boost,免疫模式为在同一免疫注射部位实施第二次免疫注射,其后立即实施EP。Ⅳ组免疫模式:prime阶段,免疫注射后立即实施EP,39 d后开始实施boost,免疫模式为在同一免疫注射部位实施EP,3 d后(即第一次免疫后第42天)实施第二次免疫注射。对照1组,仅有prime阶段,方法同Ⅰ组。对照2组,仅有prime阶段,方法同Ⅱ组。各组小鼠均在实施prime或boost后第14天处死,取脾细胞做酶联斑点免疫检测和流式细胞术分析。

1.2.2 体内电脉冲(electric pulse in vivo)方法

于DNA疫苗免疫注射部位进行体内电脉冲,技术参数如下:电压100 V,脉冲次数6次,波宽60 ms,频率60 Hz,正负电极间距5 mm。

1.2.3 小鼠脾细胞悬液的制备

颈椎脱臼法处死实验小鼠,无菌取出小鼠脾脏,并用筛网(100目)研磨成单个脾细胞,加5 ml RPMI 1640制成细胞悬液,移至预先放有淋巴细胞分离液的 15 ml离心管中,2 000 r/min离心20 min,用吸管吸取中间白色云雾状细胞,用RPMI 1640清洗1次,计数,最后用含50 ml/L胎牛血清的RPMI 1640完全培养液调整细胞数为1×107/ml,得到脾细胞悬液。

1.2.4 ELISPOT

严格按试剂操作说明书进行。其中,包被抗体为抗小鼠IFN-γ单抗,加计数好的细胞,每孔100 μl(含3×105个细胞),加抗原表位多肽至3 μg/ml,设置实验孔及对照孔;设PMA(20 ng/ml)+Ionomycin(1 μg/ml)作为阳性对照。以上实验均设3个复孔。用自动图像分析仪统计斑点数。斑点数均由3个复孔的平均值得出。

1.2.5 流式细胞术(FACS)分析

①细胞体外激活:取脾细胞悬液各1 ml,实验管加入抗原表位多肽至3 μg/ml和共刺激分子Anti-mouse CD28抗体至1 μg/ml;阳性对照管加入PMA和Ionomycin,终浓度分别为20 ng/ml和1 μg/ml,然后在各管中加入BFA 10 μg/ml,混匀后细胞在37℃、50 ml/L CO2培养箱中孵育5 h。②细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色:体外激活脾细胞,用PBS 2 ml洗2次,然后加入固定液40 g/L多聚甲醛2 ml,固定8 min,2 000 r/min离心5 min,再加含1 g/L Saponin的穿透剂200 μl,4℃暗处穿透1 h。加入20 μl CD8a FITC、IFN-γ PE、CD4 PerCP单抗于检测管中,再加100 μl上述处理过的脾细胞悬液,混匀,于4℃暗处孵育30 min,用2 ml含1 g/L Saponin的PBS洗1次,最后加入含5 g/L BSA的PBS 300 μl上流式细胞仪检测。③数据获取及分析:用Calibrite Beads校准流式细胞仪的光路和液路,调试仪器于最佳状态,仔细设置各荧光通道之间的荧光补偿,然后进行检测,每管获取细胞数20万个,用Cellquest软件进行分析。

1.3 统计学分析

各项实验数据以均数±标准差(x±s)表示,采用t检验经SPSS 12.0进行分析,P

2 结果

2.1 抗原特异性T细胞IFN-γ ELISPOT检测结果

各组小鼠在实施boost 14 d后进行IFN-γ ELISPOT检测,结果见表1。结果显示,实施prime-boost免疫策略的各实验组检测值均显著高于对照组(P0.05)。

2.2 FACS分析结果

2.2.1 CD4+ T细胞分析结果

各组经抗原多肽体外刺激后表达IFN-γ的CD4+ T细胞百分比分别为:Ⅰ组为(0.28±0.06)%,Ⅱ组为(0.29±0.11)%,对照1组为(0.22±0.07)%,对照2组为(0.24±0.08)%,各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。各组与未进行免疫的小鼠幼稚(naive)CD4+ T细胞检测结果[(0.22±0.10)%]比较,差异无统计学意义(P>0.05)

2.2.2 CD8+ T细胞分析结果

诱导的细胞表达IFN-γ的CD8+ T细胞百分比结果表明,在prime和boost阶段实施相同免疫模式的Ⅰ组[(0.82±0.16)%]、Ⅱ组[(0.79±0.11)%]与对照1组[(0.42±0.04)%]及对照2组[(0.40±0.08)%]比较,差异有高度统计学意义(P

表1不同免疫模式诱导的特异性IFN-γ T细胞频数

ELISPOT检测结果(x±s)

Tab.1The ELISPOT results of specific IFN-γ T cell frequencies induced by different immunization modes(x±s)

与对照1组和对照2组比较,*P

Compared with control group 1 and 2,*P

图1HBsAg抗原多肽特异性IFN-γ FACS检测结果

Fig.1FACS results of HBsAg antigen-polypetide-specific IFN-γ

3 讨论

乙型肝炎作为一种常见的传染性疾病,用基因工程重组的HBsAg蛋白疫苗不能起到有效的治疗作用,其主要原因在于蛋白疫苗诱导免疫保护的机制主要是促进机体产生体液免疫应答,而不能有效地诱导出细胞免疫反应。因此,治疗性HBV DNA疫苗的研究方向应主要集中于提高疫苗潜在的激发细胞免疫的能力上。

由于细胞免疫诱导的复杂性,单独使用一种疫苗很难诱导产生一种全身的、足够强度和持续性的细胞免疫应答。为了提高细胞免疫应答,一种比较容易想到的方法就是进行重复免疫,即在初次免疫后,通过相同的疫苗再次或多次进行加强免疫,大量的研究已经证明该方法能有效地提高体液免疫水平,但其对细胞免疫的促进作用却相对较低,原因在于第一次免疫产生的针对疫苗载体本身的免疫反应会大幅度地削弱再次进入的相同抗原的递呈过程。因此,解决的方法是在boost时增加免疫剂量或再利用不同类型的疫苗加强免疫,即异源prime-boost,如在prime阶段使用DNA疫苗,而在boost阶段使用重组蛋白疫苗。大量实验证明此种异源prime-boost策略在诱导细胞免疫应答方面有比较好的作用[4-6]。而Joanna等[7]则在这方面的研究中采用了另外一种方法:通过构建两种表达相同CD8+抗原表位而抗原递呈机制完全不同的真核表达质粒载体来实施prime-boost策略,结果表明,在prime和boost中分别使用类型相同但抗原递呈机制完全不同的抗原质粒进行免疫,同样能提高细胞免疫效果。

本研究结果表明,在prime和boost阶段分别使用不同联合电脉冲方法的免疫模式与相同免疫模式相比,能激发出针对HBV DNA疫苗的更强的细胞免疫效果。由于前期研究已经证明了EP+n d+DNA模式主要是通过抗原递呈细胞对抗原的直接递呈机制诱发细胞免疫反应[3],因此本研究可以证明DNA+EP模式主要是通过抗原递呈细胞摄取肌肉组织表达的外源蛋白抗原的交叉递呈机制激发宿主的细胞免疫反应。不同免疫模式的协同作用实质上是充分利用电脉冲的促外源基因转染作用和促抗原递呈功能的炎症细胞募集于注射部位的结果。

综合本研究的ELISPOT和FACS结果分析可知,体外实验中HBsAg抗原多肽诱导的特异性分泌IFN-γ的T淋巴细胞为CD8+ T细胞。已有研究表明,利用prime-boost策略诱发CD8+ T记忆和效应细胞依赖于CD4+ Th细胞[8]。因此,笔者认为该实验结果是由于检测用的抗原多肽只包含了CD8+ CTL抗原表位而缺乏CD4+ Th表位造成的。识别HBV表面抗原preS2S中的CD8+ CTL表位和CD4+ Th表位是我们下一步需要解决的问题。

利用不同抗原递呈机制的异源prime-boost策略较同源prime-boost策略能更高地促进细胞免疫应答的机制仍不清楚,这可能与不同免疫模式造成的专业递呈细胞(pAPCs)类型或递呈位置的不同以及相应的效应T细胞分布不同有关[9-12]。因此,用异源免疫模式进行加强免疫可避免效应T细胞对中心记忆T细胞扩增的抑制作用。为了更好地促进HBV DNA疫苗的免疫效果,有必要在这方面进行深入研究。

总之,本研究结果明确了DNA+EP的免疫模式主要是通过交叉递呈机制进行,并且DNA+EP与EP+n d+DNA免疫模式之间由于递呈机制的不同存在协同效应。本研究为治疗型HBV DNA疫苗临床方案的优化奠定了基础,而且对研究其他种类的DNA疫苗的细胞免疫效果也有一定的启示作用。

[参考文献]

[1]Hirao LA, Wu L, Khan AS, et al. Combined effects of IL-12 and electroporation enhances the potency of DNA vaccination in macaques [J]. Vaccine,2008,26(25):3112-3120.

[2]Yuan TF. Vaccine submission with muscle electroporation [J]. Vaccine,2008,26(15):1805-1806.

[3]Peng B, Zhao Y, Xu L, et al. Electric pulses applied prior to intramuscular DNA vaccination greatly improve the vaccine immunogenicity [J]. Vaccine,2007,25(11):2064-2073.

[4]Ramshaw IA, Ramsay AJ. The prime-boost strategy: exciting prospects for improved vaccination [J]. Immunol Today,2000,21(4):163-165.

[5]Dai Y, Zhu Y, Harn DA, et al. DNA vaccination by electroporation and boosting with recombinant proteins enhances the efficacy of DNA vaccines for schistosomiasis japonica[J]. Clin Vaccine Immunol,2009,16(12):1796-1803.

[6]Zhao HP. Prime-boost immunization using alphavirus replicon and adenovirus vectored vaccines induces enhanced immune responses against classical swine fever virus in mice[J]. Vet Immunol Immunopathol,2009,131(3-4):158-166.

[7]Joanna NR, Joanne SR, Peter SF, et al. Prime-boost with alternating DNA vaccines designed to engage different antigen presentation pathways generates high frequencies of peptide-specific CD8+ T cells [J]. J Immunol,2006,177(10):6626-6633.

[8]Bourgeois C, Veiga-Fernandes H, Joret AM, et al. CD8 lethargy in the absence of CD4 help [J]. Eur J Immunol,2002,32(8):2199-2207.

[9]Shen L, Rock KL. Cellular protein is the source of cross-priming antigen in vivo [J]. PNAS,2004,101(9):3035-3040.

[10]Wong P, Lara-Tejero M, Pamer AP, et al. Rapid development of T cell memory [J]. J Immunol,2004,175(12):7239-7245.

[11]Buchan S, Gronevik E, Mathiesen I, et al. Electroporation as a “prime/boost” strategy for naked DNA vaccination against a tumor antigen [J]. J Immunol,2005,176(10):6292-6298.

[12]Yang J, Huck SP, McHugh RS, et al. Perforin-dependent elimination of dendritic cells regulates the expansion of antigen-specific CD8+ T cells in vivo [J]. PNAS,2006,103(1):147-152.

(收稿日期:2010-01-11)