SELDI技术筛选吉非替尼治疗非小细胞肺癌优势患者的相关性研究:耐药指纹峰簇与疗效的比较分析

[摘要] 目的:探索蛋白质指纹图谱峰型与吉非替尼治疗非小细胞肺癌(NSCLC)疗效相关性。方法:选择36名NSCLC患者,服用吉非替尼治疗前行SELDI(surface-enhaceed laser desorption/ionization,表面增强激光解析离子飞行时间质谱技术)检查,吉非替尼治疗时间达1个月以上,根据实体瘤疗效评价标准分成:有效组(CR+PR)、稳定(SD)、无效组(PD)。采用ProteinChip 3.2.0软件和Biomarker Wizard 3.1软件分析每个患者的质谱图(指纹图),对图谱中指纹峰型与吉非替尼治疗NSCLC疗效相关性进行分析。结果:①经SELDI检测,在M/Z 8 400H+～8 900H+范围内形成明显峰簇。其中M/Z:(8 690±30)H+的丰度>30%,同时在M/Z 13 000～14 000范围内形成M/Z:(13 754±50)H+和(13 900±50)H+两个峰簇组成的明显峰簇,并且M/Z(6 887±30)H+是较明显上调标志,可视为预测吉非替尼治疗NSCLC无效标识,为判定不宜服用吉非替尼治疗NSCLC的界定标准。②经SELDI检测,在M/Z:8 400H+~8 900H+范围内未形成明显峰簇。其中(8 693±50)H+的丰度

[关键词] SELDI;吉非替尼;NSCLC;耐药指纹;疗效

[中图分类号] R968[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)04(b)-005-03

Study on sifting the NSCLC patients suitable to receive gefitinib therapy with SELDI: the correlation between drug resistance fingerprint cluster and effect

ZHAO Yun1, HU Shouxi1, PEI Yi2*

(1.Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.Shanxi Tumor Hospital, Taiyuan 030013, China)

[Abstract] Objective: To research the correlation between the cluster of the fingerprint and therapeutic effect of treating NSCLC with gefitinib. Methods: 36 NSCLC patients received SELDI (surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique) inspection before treatment with gefitinib, who had observable tumor evaluation therapeutic effect, and took gefitinib for more than one month. According to the responseevaluation criteria in solid tumor, the patients were again divided into 3 groups: efficacy group (CR+PR), stable group (SD) and inefficacy group (PD). The detected data were analyzed by ProteinChip 3.2.0 and Biomarker Wizard 3.1 Software, then analyzed the correlation between the cluster of the fingerprint and therapeutic effect of treating NSCLC with gefitinib. Results: ①Inspected by SELDI, there were obvious cluster on the range ofM/Z: 8 400H+-8 90H+, among this, the fingerprint which the abundance of M/Z: (8 690±30)H+>30%, formed obvious cluster consisted of M/Z: (13 754±50)H+ and (13 900±50)H+ on the range of M/Z: 13 000H+-14 000H+, and M/Z: (6 887±30)H+ was the comparatively clear upside mark, may be regarded as the mark which points out that it will be invalid to cure NSCLC with gefitinib, the criterion to judge it is not suitable to take gefitinib to treat NSCLC. So, we don't propose these patients take gefitinib. ②Inspected by SELDI, there were not obviously cluster on the range of M/Z: 8 400H+-8 900H+, among this, the fingerprint which the abundance of (8 693±50)H+

[Key words] SELDI-TOF-MS; Gefitinib; NSCLC; Drug resistance fingerprint; Drug fast fingerprint; Therapeutic effect

吉非替尼治疗非小细胞肺癌的疗效是肯定的,本课题经前期的研究已界定M/Z:(8 693±50)H+的指纹丰度30%为原发性耐药指标,不推荐此类患者服用吉非替尼[1-3],按照此标准,笔者告知那些老年人和那些不愿化疗的NSCLC患者是否可从吉非替尼治疗中获益,但是前期的研究对指纹的描述,是单定量分析,进一步的研究发现其特征性指纹呈多峰态势,且波及范围远不能用基线漂移解释,其形态多呈峰簇样改变,在一定程度上影响疗效的判断,因此,本研究将对其进行分析,探索峰簇特征与疗效的关系,现报道如下:

1 资料与方法

1.1 入组标准

经组织病理学或细胞学确诊的晚期NSCLC;年龄≥18岁;放疗和(或)化疗失败者;或因其他原因不能给予手术、放、化疗者。至少有一个可测量病灶;血常规及生化检查基本正常;无重要脏器功能衰竭;患者的生存预期>3个月。

1.2 一般资料

吉非替尼治疗患者36例,其中男13例、女23例,病理诊断均为腺癌,且未曾接受过吉非替尼治疗,其中化疗失败者26例,化疗不能耐受者10例;合并胸腔积液者6例、远处转移者17例,于服用吉非替尼前和(或)服药后1个月以上行SELDI检查。

1.3 实验工作

1.3.1 标本采集清晨空腹末梢静脉血3 ml(不抗凝),离心5 min(半径:3 000 r/m),分离出血清,-80℃低温冰箱保存。

1.3.2 主要仪器、软件及试剂PBS-Ⅱc表面增强飞行时间质谱仪(Ciphergen Biosystems,Inc.美国)、能量吸收分子EMA(Ciphergen Biosystems,Inc.美国),CM10型蛋白质芯片(Ciphergen Biosystems,Inc.美国)及相应分析软件ProteinChip 3.2.0(Ciphergen Biosystems,Inc.美国),HFPFS缓冲盐(Sigma Inc.美国),CHAPS缓冲盐(Promega Inc.美国)。

1.3.3 实验方法

1.3.3.1 血清样本处理:血清标本冰浴解冻,离心2 min(转速:10 000 r/min)。取血清样品5 μl,加10 μl 9M的尿素。振荡30 min,加180 μl缓冲液稀释(100 mmol/L醋酸钠,pH=4.0),4℃条件下离心2 min(转速:10 000 r/min),取上清液待用。

1.3.3.2 芯片处理:将芯片放入盛有100 mmol/L盐酸的试管中,振荡4～5 min,双重蒸馏水冲洗,将芯片安装到Bioprocessor上,每孔加200 μl结合缓冲液,室温振荡5 min,弃掉液体,重复1次。每孔上样100 μl已处理好的血清样品,室温振荡1 h。弃掉液体,用200 μl结合缓冲液(100 mmol/L醋酸钠,pH=4.0)洗2次,每次5 min,拆下芯片,待芯片自然干燥,然后每点加SPA 0.5 μl,共2次。干燥,用CM10蛋白芯片阅读仪读芯片[SPA=Sinapinic Acid为50% CAN(乙腈)和0.5% TFA(三氟乙酸)的饱和溶液]。

1.3.3.3 数据收集:设定检样激光强度为195,检测灵敏度为8,收集数据质荷比(M/Z)范围为1.0～2.0 KD。收集位置为20～80。平均每点收集20次,收集总点数是140次。在每次实验数据收集前,用All-in-one蛋白芯片校正仪器,使之误差

1.4 治疗方法

所有患者均停用化疗和其他抗肿瘤治疗,口服吉非替尼250 mg/d,并于服用吉非替尼前行蛋白质指纹检查。治疗期间如有肿瘤进展或毒副作用不能耐受时中止用药,服药前及服药后1个月开始常规血液学检查,针对可观察肿瘤,每2个月行影像学检查。

1.5 分析方法

1.5.1 疗效评价标准根据RECIST[4](Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)实体瘤近期疗效评价标准进行判定,即完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)及疾病进展(PD)。

1.5.2 分组方法根据WHO实体肿瘤疗效评价标准分为口服吉非替尼有效组(CR+PR),稳定组(SD)和无效组(PD),共3组。

1.5.3统计学处理用Biomarker Wizard 3.1软件比较两组血清蛋白质指纹图谱数据,寻找两组之间表达有差异的蛋白质峰,用Protine Chip 3.2.0软件分析比较两组中相同质荷比的蛋白质含量(丰度)的P值(P

2 结果

观察不同疗效时,其SELDI指纹的特征,包括M/Z、丰度和其上下游关系,伴随指纹以及有无峰簇形成。采用Biomarker Wizard 3.1软件比较分析不同临床疗效时各组之间的指纹差异,对第一阶段工作的客观性经小样本重新验证,并找出相关伴随指纹,共捕获了302个差异指纹,并经Protein Chip 3.2.0软件分析,除M/Z:13 754基线漂移±50 H+,其余基线漂移均±30 H+。其中,M/Z:(13 754±50)H+、(8 890±30)H+、(8 690±30)H+、(8 612±30)H+、(8 565±30)H+、(6 887±30)H+,共计6个有显著性差异的指纹。

进一步的分析比较,M/Z:(8 565±30)H+、(8 612±30)H+、(8 690±30)H+、(8 890±30)H+的表达在CR+PR组、SD组和PD组组间有显著性差异,且在PD组中形成极明显的峰簇,而在SD组中此峰簇不明显,在CR+PR组中几乎不形成峰簇。作为临床判断,M/Z:(8 690±30)H+、(8 693±50)H+仍是主要取值判断指标。作为另外两组有意义的指纹M/Z:(6 887±30)H+、(13 754±50)H+,在不同组中,依然存在有丰度变化。但M/Z:(13 754±50) H+和13 926H+在PD组形成了峰簇,呈显著标识。M/Z:(6 887±30)H+的丰度特征在CR+PR组、SD组和PD组组间同样依次呈上调趋势。

3 讨论

吉非替尼治疗一些特殊情况的NSCLC患者是有肯定疗效的,这个特殊情况在一年前被认为:高龄女性、不吸烟、肺腺癌是其主要适应条件[4-5],随后又采用肿瘤组织EGFR-TK基因检查[6-7],使之有效患者的覆盖率增加了,本课题组经过1年的研究,发现借助于SELDI技术捕获NSCLC患者血清中是否存在“耐药蛋白质组”的指纹,就可认为该患者是否可以从吉非替尼中获益,取得了实质性的进展,界定了SELDI指纹中,M/Z:8 693的丰度与疗效预测有关,并得出的SELDI指纹M/Z:8693,丰度30%者,不适合吉非替尼治疗;随后的研究中再次证实了这一点[8]。

通过三个阶段的研究,笔者认为SELDI技术可以通过指纹描述来预测吉非替尼治疗NSCLC的效果,以及判断服药优势人群和不宜服药人群的界定标准。采用本方法可避免NSCLC患者盲目应用吉非替尼,可以使优势人群延长获益时间。其特征性指纹描述如下:①经SELDI检测,在M/Z:8 400 H+～8 900 H+范围内形成明显峰簇。其中M/Z:(8 693±50)H+的丰度>30%,同时在M/Z:13 000～14 000范围内形成M/Z:(13 754±50)H+和(13 900±50)H+两个峰簇组成的明显峰簇,并且M/Z:(6 887±30)H+是较明显上调标志。可视为预测吉非替尼治疗NSCLC无效标识,为判定不宜服用吉非替尼治疗NSCLC的界定标准。不建议此类患者服用吉非替尼,其疗效与标识指纹符合率,不宜服药组CR+PR占0,CR+PR+SD占14.3%,PD占85.7%。②经SELDI检测,在M/Z:8 400 H+～8 900 H+范围内未形成明显峰簇。其中8 690 H+～(8 693±50)H+的丰度

总之,本研究在蛋白质质谱技术应用于肿瘤临床的工作中,进行了有益的尝试。因为恶性肿瘤的多变异特性和异质体特性,使得抗肿瘤药物适应证与实际平均治疗效果有较大差异。本研究在这个方面提供了有价值的技术支持。但是作为SELDI技术的本身,虽然是有高通、高效、可重复等优点,由于质谱仪与芯片的结合等问题,使之异机实验结果的吻合性受到了强烈的质疑,所以本研究结果之一――预测吉非替尼治疗NSCLC疗效和判断其优势人群和不宜服药人群的界定方面,采用SELDI技术进行推广应用的可行性还有待进一步评价。而采用此方法研究的另一项观察结果,发现SELDI技术可预测吉非替尼治疗NSCLC获得性耐药的发生以及判别方法。而此获得性耐药在一些患者中经治疗是可以消除的(另文发表)。这将有可能成为蛋白质质谱技术的另一个新的临床应用领域。

[参考文献]

[1]谢莉,马小军,魏淑青,等.用SELDI技术预测吉非替尼疗效的前瞻性研究报告[J].现代生物医学进展,2008,8(10):1498-1500.

[2]裴毅,胡守喜,利娜,等.蛋白质组指纹作为吉非替尼治疗肺癌适应症筛选标准的初步验证报告[J].现代生物医学进展,2009,9(7):1288-1290.

[3]孙书香,胡守喜,裴毅.吉非替尼治疗NSCLC优势人群筛选与蛋白质指纹的相关研究(1)[J].肿瘤研究与临床,2009,21(7):212-213.

[4]Therasse P, Arbuck SG, Eisenhauer EA, et al. New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors, european organization for reseach and treament of cancer, national cancer institute of the Unite States, national cancer institute of Canada [J]. J Natl Cancer Inst, 2000, 92(3):205-216.

[5]Paez JG, Janne PA, Lee JC, et al. EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefitinib thempy [J]. Science,2004,304:1497-l500.

[6]Lynch TJ, Bel DW, Sordela R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying respo nsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib [J]. N Engl J Med,2004,350:2129-2139.

[7]Baselga J. Targeting the epidermal growth factor receptorwith tyrosine kinase inhibitors:small molecules,big hopes [J]. J Clin Oncol,2002,20 (9):2217-2219.

(收稿日期:2009-12-23)