突发疫情中炭疽芽孢杆菌的实验室检测经验

摘 要 目的：结合本地区近期发生的炭疽疫情，总结关于炭疽杆菌的样本采集、分离培养、鉴定及菌种保存方面的经验，以提供借鉴。方法：采集土壤、牛羊粪便、疑似病例皮肤渗出物、血液等样本92份，分别进行涂片镜检、分离培养及鉴定。结果：其中有8份皮肤渗出物样本炭疽芽孢杆菌鉴定为阳性。结论：应尽量在消毒、抗生素应用之前采集标本，直接压片法涂片镜检率高，同时进行溶血性试验、青霉素敏感试验和噬菌体试验鉴定。

关键词 炭疽 采样 分离 鉴定

炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的一种人畜共患的传染病，人们从认识这种疾病并与之斗争已有100余年的历史［1］。我国西部农牧业地区云南、贵州、新疆等地为人间炭疽高发区，每年炭菌病例占全国炭菌病例总数的90%以上［2］。疫情来临时，实验室人员能否正确采样，快速和准确的从样品中分离鉴定出炭疽芽孢杆菌是防治疫情、诊疗患者工作的关键。

2011年7～9月内蒙古自治区兴安盟地区突发炭疽疫情，全部病例均有病死牛羊接触史，均出现了皮肤丘疹水泡、伤口破溃、有黑色焦痂形成、患肢水肿、患侧淋巴结肿大等症状，临床表现似皮肤炭疽。在此次疫情中，兴安盟疾控中心和各旗县疾控中心、各医院通力合作，采集包括土壤、牛羊粪便、疑似病例皮肤渗出物、血液等样本共92份，其中有8份皮肤渗出物样本分离出炭疽芽孢杆菌，依据WS283-2008炭疽诊断标准，此8位患者确诊为皮肤炭疽。笔者总结了在炭疽杆菌检测中采样、分离培养、鉴定及菌种保存等方面的一些经验，以提供借鉴。

样本采集

样本采集份数：对每个采样对象，宜采集4份标本，分别用于涂片镜检、直接培养、增菌培养和留样复核。

采样时间、样本类型：几年来炭疽芽孢杆菌的检出率一直较低，尤其是开展疫源地检测以来，所采集的外环境标本中从未检出炭疽芽孢杆菌，这与采集标本的及时性、季节性标本质量有着重要关系［3］。采集患者样本要尽量在应用抗生素治疗之前，采集环境标本亦最好在消毒处理之前。当采集患者皮肤渗出物标本时未用药或用药1天内分离并鉴定为炭疽菌的检出率100%，当用药超过1天时炭疽菌检出率骤降2.94%，患者血液标本检出率0%，提示皮肤炭疽患者血液标本不易检出炭疽杆菌，皮肤渗出物中炭疽菌分离率高。

采样方法：镜检发现大量两端平齐且呈串联状排列的革兰氏阳性大杆菌是炭疽感染临床诊断的依据［4］，而涂片方法决定了镜检的检出率。因直接压片法涂片能够获得较大的标本量，镜检阳性率高。但要注意玻片要高压灭菌，轻压患者创口以免扩大感染。

分离培养

可用无菌生理盐水将采样棉签浸湿，三区划线法直接涂布营养琼脂平板，这样能够获得尽可能多的菌落，避免了漏检。

增菌培养是很必要的，已确证的菌株中，有1株就是从增菌液中分离出来的。

炭疽杆菌和其他类芽孢杆菌显微镜检、菌落形态的鉴别：炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等均属于蜡样芽孢杆菌属，具有高度的同源性，形态上极其相似［5］。将已确证为炭疽芽孢杆菌的菌株和类炭疽菌加以比较。认识炭疽菌和类炭疽菌形态上的区别，有助于我们正确选取菌落进行分离纯化。炭疽芽孢杆菌较一些杂菌生长缓慢，宜在培养8～12小时时观察、分离培养，否则就可能会被生长迅速的杂菌覆盖而漏检。

鉴 定

根据WS3-2008炭疽诊断标准，确诊病例，必须分离培养到目标菌。

鉴定炭疽芽孢杆菌生物化学很少做［6］，PCR检测目前不作为确证试验。炭疽、苏云金、蜡样和巨大芽孢杆菌等属于蜡样芽孢杆菌属，具有高度的同源性；有多位点酶电泳研究认为其属于同一各种，因此在其染色体上设计引物进行检测常存在交叉反应。炭疽芽孢杆菌具有两个致病相关的质粒Pxo1和Pxo2，质粒的稳定性较染色体差，亦缺失。国内陈苏红等人采用SYBR Green1掺入法和复核探针法分别针对位于质粒Pxo1和Pxo2上的pag基因、cap基因、ropB基因进行检测评价其灵敏度、特异性，能够满足初筛的要求［7］。此次疫情中9份标本PCR扩增检测为阳性其中8份样本确证为炭疽芽孢杆菌，1份为蜡样芽孢杆菌。

确诊炭疽芽孢杆菌必须的实验室结果为显微镜检查、溶血性试验、青霉素敏感试验和噬菌体试验均为阳性。

在做噬菌体试验时，要避免噬菌体的污染，否则可能导致假阴性，一瓶新开启的噬菌体，应用若干无菌小瓶分装；怀疑污染时，可做噬菌体培养以检验是否可用。

菌株保存

从培养1天的固体培养基上用一次性接种针挑取单个菌落，穿刺半固体培养管，37℃过夜培养，第2天取出，在半固体表面滴加少量灭菌甘油。每株菌至少制备两支，记录制备支数。将菌种管置于菌种保藏盒中，4℃保存。

保存菌株时可同时再做噬菌体和青霉素试验，以保证选取菌落的正确。

参考文献

1 梁旭东.炭疽防治手册［M］.北京:中国农业出版社,1995.

2 庄汉澜.炭疽［M］.唐家琪.自然疫源性疾病.北京:科学出版社,2005:913-939.

3 马韶辉,汪春翔,葛华.两起炭疽突发疫情中炭疽芽孢杆菌的分离鉴定［J］.中国人畜共患病学报,2010,27(7):703-706.

4 卫生部.《中华人民共和国传染病防治法》规定管理的法定传染病诊断标准,2004,21-22.

5 俞东征.共患传染病学.北京:科学出版社,2009:340-341.

6 徐建国,张建中,万康林,等.现场细菌学.北京:科学出版社,2011:536-539.

7 张玲,翟俊辉,周冬生,等.荧光定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌高的实验研究［J］.中国人畜共患病杂志,2005,21(11):976-980.