HPLC法测定枳壳、香园、柚皮中柚皮苷含量

【摘 要】目的：比较枳壳、香园、柚皮中柚皮苷的含量差异。方法：采用高效液相色谱法测定枳壳、香园、柚皮中柚皮苷的含量。色谱柱为 Hypersil C18（5μm， 150mm×4.0mm），流动相为甲醇-水-乙酸（35：61：4），流速为0.8ml/min，检测波长为283nm。结果：枳壳中柚皮苷的含量为 12.41%，香园中柚皮苷的含量为8.72%，柚皮中柚皮苷的含量为2.74%。结论：通过比较得出柚皮苷含量为枳壳>香园>柚皮。

【关键词】HPLC；枳壳；香园；柚皮；柚皮苷

【Abstract】Objective： To compare the content of naringin in Fructus Aurantii and Citrus wilsonii Tanaka and pummelo pericarp. Methods：the content of naringin in Fructus Aurantii and Citrus wilsonii Tanaka and pummelo pericarp were measured by the method of HPLC. The chromatographic conditions were： Hypersil column （C18，5μm， 150mm×4.0mm），methel-water-acetic acid（35：61：4） as mobile phase，the detection wavelength at 283 nm and the flow rate being 0.8ml/min. Results：The contents of naringin in Frutus Aurantii is 12.41%，the contents of Citrus wilsonii Tanaka is 8.72%，the content of naringin in pummelo pericarp is 2.74%. Conclusion：By conparison，the content of naringin in Fructus Aurantii is the highest，follow by the Citrus wilsonii Tanaka，and pummelo pericarp at least.

【Key words】HPLC； Fructus aurantii； Citrus wilsonii tanaka； Pummelo pericarp； Naringin

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实。性微寒，味苦、辛、酸。入肺、脾、大肠经。功能理气宽中，行滞消胀。主治胸肋气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、胃下垂等[1]。香圆（Citrus wilsonii Tanaka）来源于芸香科（ Rutaceae）柑桔属（Citrus），是中药枸橼的两大植物来源之一。具有理气和中、化痰止咳的功效，中医用于缓解胃腹胀痛、呕吐、止咳嗽等症[2]。柚是柑橘中的一大类，是人们喜爱的水果之一。枳壳、香园、柚皮中都含有柚皮苷，柚皮苷是一种二氢黄酮类化合物，具有抗氧化、抗病毒、抗癌、抑菌以及增加其他药物利用度等重要生物活性[3-5]。本实验主要是采用高效液相色谱法分别测定枳壳、香园、柚皮中柚皮苷的含量，然后对三种供试品中的柚皮苷含量进行比较分析。为柚皮苷活性成分提取原料的选择提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国Aglient 1100 高效液相色谱仪，VWD紫外检测器，Aglient 化学工作站，Millipore Simplicity-185 超纯水器，BT224S电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）。

1.2 试药与试剂

柚皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110722-200610，供含量测定用），甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。

1.3 供试样品

枳壳、香园购自桂林市建干路毕生医药药店，经鉴定枳壳为芸香科植物酸橙的干燥未成熟果实，香园为芸香科植物枸橼的干燥果实。柚皮为无病虫害的柚皮，在60℃烘干粉碎备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18 柱（150×4.0mm，5μm），流动相：甲醇：水：乙酸（35：61：4），流速0.8ml/min，检测波长283nm。在上述条件下，柚皮苷色谱峰能完全分离。色谱图见图1、图2、图3、图4。

图1 对照品HPLC图

图2 枳壳提取物HPLC图

图3 香园提取物HPLC图

图4 柚皮提取物HPLC图

2.2 供试品溶液的制备

取各样品粗粉0.2g，精密称定，置于150ml圆底烧瓶中，加入50ml 50%甲醇，加热回流提取60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，摇匀，过微孔滤膜（0.45μm），即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取柚皮苷对照品5mg，置于25ml的容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀（0.2mg/ml），再精密量取1ml，置于10ml容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（20μg/ml）。

2.4 线性关系的考察

精密量取柚皮苷对照品储备液 （0.2mg/ml） 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml分别置于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀；按上述色谱条件，分别精密吸取各对照品溶液20μl，依次注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积积分值为纵坐标，柚皮苷对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线。得其回归方程为：A=21722C+5.6434r=0.9997（n=6）。结果表明，在上述色谱条件下，柚皮苷进样浓度在0.02～0.12mg/ml范围内与峰面积值呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液（20μg/ml）和供试品溶液各20μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，各测定5次，对照品溶液柚皮苷峰面积的RSD为0.25%。枳壳、香园、柚皮供试品溶液柚皮苷峰面积的RSD分别为0.21%，0.32%和0.37%。结果表明精密度良好。

2.6 稳定性试验

在上述色谱条件下，精密吸取枳壳、香园、柚皮供试品溶液各20μl，于0，6，12h进样，分别测定峰面积。测得枳壳、香园、柚皮供试品溶液柚皮苷峰面积的RSD分别为0.26%，0.35%和0.21%。结果表明各供试品溶液12h内稳定。

2.7 重复性试验

按供试品溶液制备方法，精密称取同一枳壳、香园、柚皮供试品各0.2g，每种样品称取5份，分别制备后进样20μl，测定峰面积。测得枳壳供试品柚皮苷峰面积的RSD为0.21%，香园供试品柚皮苷峰面积的RSD为0.27%，柚皮供试品柚皮苷峰面积的RSD为0.49%。结果说明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已测定含量的枳壳样品（含量为12.41%），香园样品（含量为8.72%），柚皮样品（含量为2.74%）各0.2g，每种样品称取5份，分别加入一定量的对照品溶液，按2.2项下制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定峰面积，计算回收率。结果枳壳样品柚皮苷的平均回收率为100.8%（n=5），RSD为1.83%，香园样品柚皮苷的平均回收率为98.2%（n=5），RSD为1.27%，柚皮样品柚皮苷的平均回收率为99.8%（n=5），RSD为1.10%。

2.9 样品含量测定

取枳壳、香园、柚皮供试品各0.2g，精密称定，照供试品溶液制备项下操作，制成供试品溶液。在上述色谱条件下，精密吸取各供试品溶液20μl，分别注入高效液相色谱仪，按照外标法测定各样品中柚皮苷的含量。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本实验采用相关文献报道的流动相甲醇-水-冰醋酸（30：68：2）[6]，甲醇-水-冰醋酸（30：63：3）[7]，乙腈-0.1%磷酸（24：76）[8]时，峰有拖尾，分离效果都不太好。流动相的配比可显著影响样品的保留时间，对分离效果也有一定的影响，但影响不是很大。在选择流动相的比例时发现，增加流动相中甲醇的含量，可以缩短保留时间。在分离效果上，增加醋酸的浓度，可明显改善分离效果，也可减少拖尾现象。其次，柱温、流速也对保留时间、分离效果及峰形有一定的影响。通过运用HPLC对枳壳、香园、柚皮提取物中柚皮苷的含量进行测定，确定最佳色谱条件为：色谱柱为Hypersil C18 柱（150×4.0mm，5μm）；流动相：甲醇：水：乙酸（v：v：v=35：61：4），流速0.8ml/min，检测波长283nm，进样量为20μl。该方法使不同组分色谱峰达到基线分离， 峰形良好，样品柚皮苷出峰时间与柚皮苷标准品基本一致。

3.2 供试品制备方法的选择

枳壳、香园、柚皮中的共同的有效成分都是柚皮苷，综合相关文献资料和常规的提取方法，考察了不同浓度的甲醇和乙醇提取，结果表明50%的甲醇对三种供试品的提取率最高；考察了加热回流提取法和超声波辅助提取法，结果表明加热回流提取60min的效果最佳。最终确定了用50%甲醇加热回流60min对三种供试品进行提取，该方法简单易行，易于操作，而且重复性好。

3.3 结论

本实验选取了三种含有柚皮苷物质的常见药物，采用相同的提取方法从这三种物质枳壳、香园、柚皮中提取出柚皮苷，三种供试品称取质量相当的情况下，测得三种样品中柚皮苷的含量，枳壳中最多，香园次之，柚皮最少。枳壳、香园、柚皮如果是不同批次，不同产地之间它们之间柚皮苷的含量也会有所差异，本实验也就只是对某个产地，某个批次的枳壳，香园，柚皮中的柚皮苷进行含量比较。运用较少原料提取出多的柚皮苷，可以考虑从枳壳中提取柚皮苷。虽然柚皮中柚皮苷含量较少，但我国是个柚子生产大国，具有丰富的柚皮资源，也可以考虑从大量的柚皮中提取出柚皮苷。

【参考文献】

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[5]Yoshiyuki Shirasaka，Yan Li，Yuta Shibue，etal. Concentration-Dependent Effect of Naringin on Intestinal Absorption of ？1-Adrenoceptor Antagonist Talinolol Mediated by P-Glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypetide （Oatp）[J]. Pharmaceutical Research，2009，26（3）：560-567.

[6]王萍，李莉，张静，等.香园叶中柚皮苷的含量测定[J].安徽农业科学，2011，39（32）：19789-19790.

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[8]郭绮丽，吕武清，曾莉萍，等.HPLC测定陈皮-枳壳药对提取物中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（20）：100-102.