微生物质控考核盲样检测的分析

【摘要】目的通过质控考核提高微生物实验室检测能力，检验人员技术水平，增强实验室竞争力。方法依据国家标准GB/T4789-2003，GB/T4789-2008，GB4789-2010对质控盲样中食源性致病菌（阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠杆菌O157：H7/NM，志贺氏菌、空肠弯曲菌，溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌）进行分离鉴定。结果经分离鉴定，质控盲样中检出阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌，根据国家食品安全风险评估中心结果反馈，本次考核结论为满意。结论本次质控考核使用选择性强、特异性高的显色培养基及VITEK2 compcat微生物鉴定仪，使检测更加快速、特异、敏感，检测结果更加准确可靠。

【关键词】质控考核；阪崎肠杆菌；单核细胞增生李斯特菌；分离鉴定

卫生微生物检测的质量控制，是实验室内检测工作的基础，直接关系到细菌学检测结果的准确性和可靠性。本实验室自2000年起每年参加省疾控中心等相关机构组织的检测能力验证计划，均取得了优异成绩，2012年首次参加国家食品安全风险评估中心组织的全国相关食品检测机构质控盲样（奶粉）中食源性致病菌分离鉴定，现将本次质控结果分析总结如下：

1资料与方法

1.1待测样品奶粉质控盲样（粉状固体、塑料瓶装）。

1.2仪器设备VITEK2 compcat微生物鉴定仪，恒温培养箱，生化培养箱等。

1.3培养基和试剂氯化镁孔雀绿（MM）亚硒酸盐胱氨酸增菌液，缓冲蛋白胨水，7.5%氯化钠肉汤，LB增菌液，GN增菌液，1%葡萄糖肉汤，3%氯化钠碱性蛋白胨水，mLST-Vm增菌液，mEC肉汤，Bolton肉汤，CIN-I平板，skirrow琼脂平板，DFI琼脂平板，B.P平板，MYP平板，伊红美兰（EMB）平板，SS平板，HE平板，skirrow琼脂平板与mCCD平板，克氏双糖，血平板均购自广东环凯微生物科技有限公司，有效期内使用。

1.2检测依据GB/T4789.5，11，13，14-2003，GB/T4789.7，8，9，36-2008，GB4789.4，10，30，40-2010所有操作均在BSL-2生物安全实验室或万级净化实验室进行，注意生物安全和无菌操作。

2检测与结果

2.1增菌与分离无菌操作，打开样品管，接种环蘸取半固体分别直接划线HE平板、SS平板、EMB平板、血平板、B-P平板、O157H7显色平板、科玛嘉沙门氏菌显色平板、科玛嘉副溶血性弧菌显色平板、skirrow琼脂平板、mCCD平板、P.K平板、CIN-I平板，DFI显色平板、科玛嘉李斯特氏菌显色平板MYP平板。除CIN-I平板26℃培养、skirrow琼脂平板与mCCD平板42℃微需氧培养、科玛嘉李斯特氏菌显色平板30℃培养，其余平板均置37℃需氧培养。同时半固体菌种管直接接种各选择性增菌液中37℃需氧培养（除LB1增菌液30℃培养24h，TTB增菌液42℃24h，PSB增菌液26℃培养48h，Bolton肉汤微需氧42℃培养24-48h，mLST44℃24）后再接种相应的平板培养。

2.2观察菌落形态（培养24h）经过培养后，平板上可见：EMB：圆形，光滑的紫红色菌落。HE：圆形，光滑边缘整齐的黄色菌落。CIN-I：圆形光滑凸起湿润红色菌落。SS：圆形光滑的湿润的粉红色菌落。科玛嘉沙门氏菌显色平板：蓝绿色圆形光滑的菌落。血平板：淡黄色圆形光滑小菌落。科玛嘉O157H7显色平板上：可见圆形光滑蓝绿色的菌落。

科玛嘉付溶血性弧菌平板：未见菌落生长。科玛嘉李氏菌显色平板：蓝绿色带晕圈可疑菌落。B.P平板：未见菌落生长。DFI平板：蓝绿色圆形光滑的可疑菌落。skirrow琼脂平板：灰白色菌落。mCCD平板：灰白色菌落。MYP平板：黄色圆形光滑菌落。

观察增菌液划线的平板：平板菌落形态同直接划线平板。

2.3初步生化试验及染色镜检将CIN-I上圆形湿润红色菌落挑选5个接种改良克氏双糖26℃培养，同时做尿素酶试验（结果为阴性）。科玛嘉沙门氏菌显色平板上蓝绿色菌落，O157H7显色平板上蓝绿色菌落，SS平板上粉红色菌落，HE平板上黄色菌落，DFI平板上蓝绿色的菌落，EMB上紫红色菌落各挑3-5个分别穿刺双糖斜面37℃培养观察均斜面和底层均变黄产气，同时挑取上述平板单菌落划线营养平板并做氧化酶试验及镜检。科玛嘉李氏菌显色平板上蓝绿色带晕圈可疑菌落镜检为革兰氏阳性小杆菌，上述其余平板上所有挑选的菌落氧化酶试验均为阴性，镜检均为革兰氏阴性小杆菌。

2.3.1挑取科玛嘉李斯特氏菌显色平板上蓝绿色带晕圈可疑单菌落穿刺血平板做溶血试验（37℃培养24h后刺种点周围可见狭小透明溶血环）及穿刺半固体做动力试验（30℃培养3d后可见倒伞状生长）。

2.3.2挑取DFI平板上蓝绿色的可疑单菌落接种TSA平板培养做进一步生化鉴定DFI平板上转TSA平板上黄色菌落上VITEK2compcat微生物鉴定仪经鉴定为阪崎肠杆菌生化反应。

3讨论

混合菌种盲样的鉴定是卫生微生物实验室能力验证的常用方法，对检测工作来说，实验室间质控和能力验证是提高检测能力的有效手段，对检测结果起到复核和证明作用，也是对检验人员技能、实验室内质量控制的检验，使实验室对检测结果心中有底，以及时发现问题，纠正错误，从而保证出具的检验结果准确、可信。

质控盲样检测不同的菌种，应根据鉴定的要求，尽可能制定全面的检测方案，检测人员应具有扎实的理论知识和丰富的实践工作能力。本次比对活动要求鉴定奶粉中的致病菌，同时检出其他菌一并报告。因此在进行鉴定时，应考虑各种致病菌的生长要求和特性，选择多种分离增菌液、平板，尽可能多挑取各平板上的可疑菌落进行鉴定，避免漏检。培养基的制备和使用是微生物检测的重要环节，培养基的质量直接影响到检测结果的准确性。应选择有合格供应资质的试剂公司购买合格产品，并在有效期内使用。平板在使用前应无明显水珠，潮湿的平板可能造成菌落扩散，影响分离结果。近年来，由食源性致病菌引起的食物中毒的不断发生，范围广、危害大，已引起各国政府的高度重视，除了常见的引起食物中毒的食源性致病菌如沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌外，一些以往并不常检的食源性致病菌如单核细胞增生李斯特菌、阪崎肠杆菌及空肠弯曲菌等引起的食源性疾病屡有报道，因而增加检验项目增强对其的检测能力可对食物中毒原因的快速排查具有重要意义。

接收质控样品时应认真核对样品性状，仔细阅读作业指导书。实验人员应严格按国家标准并结合作业指导书的方法进行操作，对样品原液的直接分离鉴定和增菌后的分离培养鉴定缺一不可。在样品中菌种比例差异较大的情况下，增菌后分离培养可能使劣势菌无法生长或生长很少而被忽略。作业指导书中提及的一些信息，比如保存环境，在鉴定时可排除一些对环境有特殊要求的菌种。

总之，通过参加国家食品安全风险评估中心组织的全国相关食品检测机构能力比对，提高了实验室检验人员对突发传染病、细菌性食物中毒的病原诊断及应急能力，促进国家认可实验室水平的不断提高。

参考文献

[1]夏铮铮，刘卓慧.实验室认可与管理基础知识[M].北京：中国计量出版社，2003.

[2]陆娟，王波.一份混合菌种质控盲样的鉴定分析[J].中国卫生检验杂志，2008，18（9）：1920-1921.

[3]张嵘，江晓，叶艳华，等.一支半固体盲样中食源性致病菌分离鉴定[J].中国医学创新，2013，10（5）：145-146.