聚合酶链反应检测肿瘤细胞P16基因缺失及其临床意义

【摘要】目的探讨P16基因缺失与肿瘤的关系。方法用聚合酶链反应技术，检测56例肝癌、25例白血病患者的P16基因缺失情况。结果56例肝癌患者中有13例P16基因缺失，25例白血病患者中有8例P16基因缺失，缺失率分别为23.2%，32.0%。结论P16基因缺失与肿瘤的发生关系密切，检测P16基因缺失有助于肿瘤的辅助诊断。

【关键词】P16基因；聚合酶链反应；肿瘤；基因缺失

100文章编号：1004-7484（2014）-06-3085-02

肿瘤的发生发展与多种遗传基因改变有关，P16基因又称MTS1或CDK4I，位于人类第九号染色体短臂（9P21）上，全长8.5kb，由三个外显子和两个内含子组成，其编码16KD产物即P16蛋白。MST1作为CDK4的抑制因子，抑制细胞的分裂，增殖。

1资料与方法

1.1标本

1.1.156例肝癌标本来自新沂市第二人民医院病理科肝癌标本已经脱水石蜡包埋。31例肝硬化标本来自新沂市第二人民医院外科。

1.1.225例白血病标本来自新沂市人民医院血液科20例正常对照组来自健康体检者。

1.2DNA提取①石蜡包埋的肝癌标本：把标本切碎置离心管中，二甲苯脱蜡，12000r/min离心4min，吸取上清夜，加入无水乙醇，混匀离心，吸去乙醇，开盖静置5min，让乙醇挥发；加入蛋白酶K缓冲液，55°C3h，7000r/min离心5min，95°C8min灭活蛋白酶K，离心后取上清液作反应模板。肝硬化标本切碎后直接加蛋白酶K缓冲液，以下操作同前。②白血病细胞标本：白血病经骨髓片检查确诊。取抗凝血200ul，加500ul溶胞液，冰浴10min，5000r/min离心10min，去尽上清液，沉淀内加入500ul溶胞液，混匀，冰浴10min，去尽上清，沉淀内加入裂解酶60ul，混匀，100Cmin，8000r/min离心5min，取上清液于另一管内加处理液5ul，再加入250ul无水乙醇，倒转几次，12000r/min离心5min，去尽上清液，开盖静置5min，加入20ul双蒸水溶解沉淀，作为反应模板。

2结果

2.156例肝癌标本中有13例P16基因缺失缺失率为23.2%；而31例肝硬化标本中仅有1例P16基因缺失，缺失率为3.2%。

2.225例白血病标本中有8例P16基因缺失缺失率为32%，而20例正常对照者则未发现P16基因缺失。

3讨论

真核细胞分裂必须经过两个关键环节：G1-S期和G2-M期。CDKs是细胞周期调节中心，其成员的激活和磷酸化促进细胞从G1-S期和G2-M期的转变。P16基因通过其表达产物P16蛋白与CDK4结合抑制CDK4的功能。CDK4与CyclinD1结合能使细胞周期进入G1期，而P16蛋白与CDK4结合后，使pRB（视网膜母细胞瘤基因蛋白）磷酸化作用减小，导致转录因子E2F释放减少，细胞从G1期至S期受抑制，从而使细胞生长停滞。在我们检测的标本中，56例肝癌有13例P16基因缺失，缺失率为23.2%，而31例肝硬化标本仅有1例P16基因缺失，缺失率为3.2%。肝癌中P16的变异应该高于23%，因为P16的其它变异如重排、点突变和P16CPG过度甲基化都没有进行检测，并且正常细胞混杂有可能掩盖P16基因的缺失，导致检出率降低。25例白血病中有8例P16缺失，缺失率为32%多重PCR检测ALL病人骨髓标本，用DNA印迹法检测骨髓的缺失率一致。而20例正常对照者未发现P16基因缺失。

参考文献

[1]Kamb A，N A Gruis，J Weaver-Feldhaus，et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science，1994，264：436-440.

[2]Serrano M，Hannon GJ，Beach D.A new regulatory motif in cell-cyle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4，Nature，1993，366：704-707.