中国H5N1流感病毒神经氨酸酶的进化分析

【摘要】目的研究新型甲型H5N1流感病毒神经氨酰酶的进化规律。 方法采用MEGA软件对H5N1神经氨酸酶氨基酸序列进行种系发生树的构建及序列同源性的分析。结果 发现地域对流感病毒的进化有直接影响。同源比对显示神经氨酰酶存在部分高变位点。 结论为基于受体的抗流感药物设计提供理论基础。

【关键词】流感病毒；神经氨酸酶（NA）；种系发生树；进化

引言

流行性感冒病毒简称流感病毒，是造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒。流感病毒的主要抗原是HA和NA两类活性蛋白质。NA和HA两种抗原氨基酸序列的突变能直接导致流感病毒的变异[1] 。研究表明HA抗原复杂多变，所以以NA为靶点设计新的抗流感药物已经成为现代药物设计的主流[2] 。因此，本研究通过研究流感病毒中NA蛋白在中国的进化与关键位点的变化情况，为以后抗流感新药设计提供理论支持。

1材料与方法

1.1病毒序列来源研究中所用的序列来源于美国生物信息中心NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），获得2006-2011年中国各地不同宿主（人、禽。猪）甲型流感病毒H5N1亚型的蛋白质序列189条。为了研究中国以人为宿主的流感病毒神经酰胺酶的进化关系，进一步筛选出32条序列做进化和突变分析。

1.2进化树的构建将之前筛选得到32株人源H5N1流感病毒神经酰胺酶的氨基酸序列进行完全比对，然后用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.5（MEGA 5.5）软件做进一步的bootstrap进化树分析，最后进行种系发生树的构建。

2 结果

2.1 H5N1甲型流感病毒NA的进化分析2006－2010年H5N1甲型流感病毒NA的进化分析进化树的各主要节点上，其Bootstrap值均大于50％，表明所得到的进化树结构是可信的。2006－2012年中国各地人源32例H5N1亚型流感病的NA氨基酸序列的种系发生树主要分为2个主干（图1）：新型流感病毒几乎都位于Ⅰ类分支。中国境内地域相近的，流感病毒的亲缘关系也较近。

2.2H5N1甲型流感病毒NA同源性分析用MEGA5.50中相关程序处理后使得所有序列完全比对。比对结果显示，禽类 A/duck/Zhejiang/2245/2011(H5N1)和A/goose/Shantou/3624/2006(H5N1)这两条序列亲缘关系最近。而人源的H5N1神经氨酸酶序列的第49―68位上的氨基酸都是缺失的。同源对比发现V46A/D、R70S、N78K 、I94V 、D270N 、T289I 、V346I 、P365T 、N386E/S/D为高变位点。这些位点的变异可能导致神经氨酸酶发生抗原性变异，从而导致流感的大爆发。

3讨论

在流感病毒的生命循环中，病毒表面蛋白质血凝素和神经氨酸酶对于流感病毒的侵入和传播起着非常重要的作用。其中NA 即神经氨酸酶,能催化裂解病毒蛋白末端神经氨酸残基与糖蛋白，从而促进新形成的病毒颗粒从感染细胞中分离与扩散，促进病毒颗粒从感染的呼吸道黏膜向周围组织扩散[3] 。因此，深入了解NA的进化模式有助于抗流感新药设计研发的顺利进行。从图1进化树中可以看出，除了山东发现的2009年H5N1 (A/Shandong/1/2009(H5N1))和北京(A/Beijing/1/2009(H5N1))发现的流感病毒外，其余2009年的此类病毒基本上都属于同一进化分支。说明2009年我国发现的H5N1流感病毒基本都是同一进化起源。

本研究对H5N1 流感病毒NA基因编码蛋白的氨基酸序列的同源性进行分析， 尤其是NA蛋白可能的抗原决定簇、受体结合位点及周围相关位点的变异情况。研究发现，位于抗原决定簇中心部位的氨基酸虽然发生了替换，但是并不影响抗原决定簇中心的空间构型。然而人源NA氨基酸序列的第49―68位上的氨基酸都发生20个氨基酸缺失的现象。由于NA蛋白的酶活性中心位于NA头部，所以这一缺失现象也许可以说明为什么2009年出现的新型流感病毒对传统抗流感药物产生耐药性[4] 。

参考文献

[1] Ahn I, Son H S. Comparative study of the hemagglutinin and neuraminidase genes of influenza A virus H3N2, H9N2, and H5N1 subtypes using bioinformatics techniques.[J]. Can J Microbiol,2007,53(7):830-839.

[2] Osterholm M T, Kelley N S. Mammalian-Transmissible H5N1 Influenza: Facts and Perspective.[J]. MBio,2012,3(2).

[3] Balasubramaniam V R, Wai T H, Omar A R, et al. Cellular transcripts of chicken brain tissues in response to H5N1 and Newcastle disease virus infection.[J]. Virol J,2012,9:53.

[4] Chen Z, Kim L, Subbarao K, et al. The 2009 pandemic H1N1 virus induces anti-neuraminidase (NA) antibodies that cross-react with the NA of H5N1 viruses in ferrets.[J]. Vaccine,2012,30(15):2516-2522

作者简介：沈霞，女，（1979-），陕西咸阳人,博士，讲师，研究方向：生物信息学

基金项目：陕西省教育厅（11JK0689）.

图12006－2012年中国各地人源32例H5N1亚型流感病的NA氨基酸序列的种系发生树