黄芪甲苷对人外周血内皮祖细胞体外血管生成能力的影响

摘要：目的 观察黄芪甲苷对体外培养的人外周血内皮祖细胞（EPCs）数量及增殖、迁移、黏附功能、血管生成能力的影响。方法 密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞，FITC标记荆豆凝集素Ⅰ（FITCUEAI）、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiIacLDL）荧光双染鉴定，流式细胞仪检测细胞表面标志。单个核细胞培养4 d后进行实验分组，分为对照组和黄芪甲苷干预组。干预组加入不同浓度的黄芪甲苷（分别为10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL） 培养72 h。分别采用四氮唑溴盐比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定来观察EPCs 的增殖、迁移和黏附能力；体外血管生成试剂盒来观察EPCs体外血管生成能力。结果 与正常对照组比较，黄芪甲苷组EPCs数量增加，EPCs的黏附、迁移、增殖和体外血管形成能力增强，且黄芪甲苷20 μg/mL时作用最显著。结论 黄芪甲苷可增加体外培养的EPCs数量，改善EPCs 增殖、迁移、黏附和体外血管生成能力等生物学功能。

关键词：黄芪甲苷；内皮祖细胞；血管生成能力

中图分类号：R329.2 R289.5 文献标识码：A 文章编号：1672

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一类能增殖并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞[1]。有研究显示，EPCs不仅参与人胚胎血管生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程[2]。目前，EPCs介导的治疗性血管再生及损伤血管修复已经成为心血管疾病治疗的研究热点之一。血管生成能力是EPCs最重要的功能之一。黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ）也称黄芪皂苷甲、黄芪皂苷Ⅳ，是从中药黄芪中分离得到的一种具有多种药理活性的皂苷类化合物，具有调节机体免疫力、保护组织器官、降低血糖、抗细胞凋亡和抗炎、抗病毒等多方面的药理作用。有研究表明，黄芪甲苷可减少心肌细胞损伤和阻止内皮细胞功能障碍[3]。本研究主要观察黄芪甲苷对体外培养外周血EPCs血管生成能力的影响，探讨其可能的血管保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 FITC标记荆豆凝集素Ⅰ（ FITCUEAⅠ）购自Sigma公司； DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiIacLDL ）、人纤维连接蛋白（HFN） 购自Chemicon 公司；血管内皮生长因子（VEGF） 和碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF） 购自Peprotech 公司；FITC 标记抗CD34 抗体、抗CD133抗体和KDR购自BD 公司；DETANO购自Molecular Probe公司；M199、胎牛血清购自Hyclone；1∶250胰蛋白酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司，进口分装；人外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；体外血管形成试剂盒（Sigma公司）；黄芪甲苷（上海融禾公司）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs分离 取外周血10 mL，肝素抗凝，采用密度梯度离心法获取单个核细胞，接种在24孔板上。应用M199培养基（含20%胎牛血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL）培养，每3 d～4 d换液，去除非贴壁细胞。换培养液继续培养至7 d，PBS液去除非贴壁细胞，对贴壁细胞进行细胞鉴定。

1.2.2 EPCs细胞鉴定 获取的外周血单个核细胞，以2×106/mL～3×106/mL接种在纤连蛋白包被24孔板及6孔板，培养第4天取出，将细胞与2.4 ng/mL的DiIacLDL在37 ℃温度下孵育1 h，以检测内皮祖细胞对DiIacLDL的摄取。采用2%多聚甲醛固定细胞10 min。应用PBS清洗2 min，将10 ng/mL的FITCUEAI加于上述标本，在37 ℃温度下孵育1 h。采用激光共聚焦显微镜鉴定DiIacLDL和UEAI双染色阳性细胞被认为是正在分化的内皮祖细胞。倒置荧光显微镜对每孔细胞进行计数，随机选择15个随机显微镜视野（×400倍）的内皮祖细胞进行计数。对细胞进行鉴定，采用流式细胞仪检测细胞的表面标志[4]。

1.2.3 实验分组 培养4 d后，收集贴壁细胞并随机分为4组，正常对照组（A组），黄芪甲苷低（10 μg/mL）、中（20μg/mL）、高（40 μg/mL）剂量干预组（B组、C组、D组）。培养72 h后，进行细胞功能检测。

1.2.4 细胞集落、梭形细胞计数 用光学显微镜计数15个随机显微镜视野（×200倍） 的梭型细胞数目。培养第7天，用光学显微镜计数15个随机显微镜视野（×200倍）细胞集落。

1.2.5 EPCs黏附能力检测 用0.25%胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，悬浮在500 μL培养液并计数，然后将同等数目的EPCs铺在24孔板，在37 ℃ 5%CO2孵箱培养1 h后，计数贴壁细胞。不同浓度罗格列酮共培养48 h后，将同等数目的EPCs 接种在包被有人纤维连接蛋白培养板，在37 ℃下培养30 min，计数15个随机200倍视野中贴壁细胞[4]。

1.2.6 EPCs迁移能力检测 将200μL培养液和50 ng/mL的血管内皮生长因子（VEGF）20 μL，加入改良的Boyden小室的下室，将2×105内皮祖细胞悬浮在100 μL培养液注入上室，在37 ℃ 5%二氧化碳孵箱培养6 h，取出微孔滤膜，PBS漂洗，以无水乙醇固定，Harris苏木精染色，在37 ℃温度下烤膜过夜，无水乙醇脱水，二甲苯透明滤膜。对迁移到低层的细胞进行计数，选择3个随机显微镜视野（×400倍）进行计数[4]。

1.2.7 EPCs增殖能力的检测 培养4 d后，0.25%胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，500 μL培养液重悬细胞计数，再将等量EPCs接种到包被有人纤维连接蛋白96孔培养板，同时加入雌二醇使其终浓度为0.001 μmol/L、0.01 μmol/L、0.1 μmol/L，培养48 h，加入MTT，6 h后吸弃上清液，加入DMSO，于微量振荡器充分振荡10 min，波长562 nm处测吸光度值[4]。

1.2.8 EPCs血管生成能力的检测 采用体外血管生成试剂盒检测体外内皮祖细胞的血管生成能力。200倍倒置显微镜下观察小（血）管生成情况。选择200倍光镜下5个视野，计数小管数。细胞拉长变形，长度为宽度的4倍以上即可被认为形成小管。

2 结 果

2.1 EPCs的细胞形态学特征及鉴定 细胞形态学显示，刚分离的细胞呈圆形不贴壁，4 d可以观察到椭圆形、短梭形细胞；培养第7天，梭形细胞逐渐增多。

外周血获取的单个核细胞接种在细胞培养板内，培养7 d后对贴壁细胞进行细胞鉴定分离获得的单个核细胞，培养7 d用FITCUEAI和DiIacLDL对细胞进行染色。通过共聚焦显微镜，DiIacLDL、FITCUEAI双染色阳性细胞（呈黄色）被认为是正在分化的内皮祖细胞。

外周血获取的单个核细胞培养7 d后，采用流式细胞仪检测细胞表面标志，其中表达CD133（18.73±7.12）%，CD34（32.15±8.68）%，KDR（69.45±8.21）%，进一步证明获得的细胞为内皮祖细胞。

2.2 不同浓度黄芪甲苷对体外培养EPCs生物学功能的影响（见表1）

3 讨 论

血管内皮的损伤和修复保持着动态平衡，维持血管内皮结构及功能的完整。血管内膜轻微受损，通过邻近内皮细胞增殖来修复，而强烈内膜损害要通过循环中血管内皮祖细胞归巢到损伤部位来修复。器官与组织的血管新生主要通过血管形成（angiogenesis）和血管生成（vasculogenesis）两种机制。血管形成是指内皮细胞增殖和迁移，以出芽或套迭的方式，从已存在的血管床中长出，形成新的血管；血管生成是由血管内皮祖细胞原位分化、聚集，形成血管。传统的观点认为，血管形成在胚胎及成体都存在，而血管生成仅限于胚胎发育阶段。1997年，Asahara等[1]首次分离并证实成年大鼠骨髓中存在着能分化为血管内皮细胞的EPCs，并在体内证实了其生成血管的能力。来源于骨髓的内皮祖细胞增殖、趋化、分化，参与新生血管的形成，更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复理论，并为血管再生相关性疾病的研究治疗提供了新思路。有研究证实，EPCs不仅参与胚胎时期的血管生成，同时也参与出生后血管新生及受损血管内皮再生[5]，随着干细胞研究的不断深入，EPCs介导的治疗性血管新生及损伤血管修复正逐渐成为心血管研究领域的重点。目前，通过各种途径向体内移植或动员机体自身的EPCs可以促进损伤血管内膜的再内皮化、抑制内膜的超常增生、提高缺血组织的血管再生能力[6]。研究显示，他汀类药物、雌激素、血管内皮生长因子（VEGF）和基质细胞衍生因子1（SDF1）均具有动员骨髓EPCs，修复损伤内皮细胞的能力[7，8]。

黄芪中的主要活性成分为黄芪皂苷、黄芪多糖（astragalus polysaccharides）和黄芪异黄酮（isoflavones），目前主要采用黄芪皂苷中的黄芪甲苷作为评价黄芪药材质量优劣的标准[9]。有研究表明，黄芪甲苷具有清除氧自由基，抗脂质过氧化作用[10]。黄芪甲苷能够减轻急性高糖引起的人类脐静脉内皮细胞的内皮屏障功能的损伤，抑制内皮电阻抗下降及单层内皮细胞渗透性的增大[11]。黄芪甲苷通过抑制缺氧复氧引起的血管内皮细胞核转录因子κB（NFκB）表达，减轻血管内皮细胞与中性粒细胞黏附，对缺氧/复氧损伤血管内皮细胞具有保护作用，且呈剂量依赖性[12]。有研究亦发现，黄芪甲苷可降低高糖诱导的血管平滑肌细胞的增殖，而且可降低高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖，并且升高了的血管平滑肌细胞的增殖指数也被降低，并呈剂量依赖性[13]。本研究通过对体外培养EPCs 应用不同浓度黄芪甲苷干预后发现，黄芪甲苷可增加体外培养EPCs 数量，能够改善EPCs 的增殖、黏附、迁移及体外血管生成能力，其作用效果在20 μg/mL时最明显。

参考文献：

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