乙肝表面抗体衰减人群细胞免疫状态和影响因素分析

摘要：[目的]探索乙肝疫苗接种人群免疫状态和乙肝表面抗体衰减的影响因素。[方法]采用多阶段随机抽样的方法，在上海市卢湾区和松江区随机抽取600名既往全程接种乙肝疫苗的对象，将其中HBsAg、抗－HBc阴性且抗－HBs100 mIU／mL、性别相同、年龄±1岁的对象作为阳性对照组，检测IFN－γ和IL－4。[结果]多因素非条件Logistic回归模型提示，免疫年限(OR=2.01)、牙科治疗史(OR=1.55)和婚姻状况(OR=13.17)与人群乙肝表面抗体衰减存在密切联系。细胞免疫检测提示，乙肝表面抗体衰减实验研究组对象的IFN－γ阳性细胞百分比和IL－4阳性细胞百分比均显著低于实验对照组。[结论]乙肝表面抗体衰减者清除HBV的特异性细胞免疫可能和体液免疫一样均处于弱化状态，推行乙肝疫苗加强免疫策略应该是今后乙肝防治工作的重点。

关键词：乙肝表面抗体；衰减；乙肝疫苗；加强免疫

中图分类号：R512.6+2　文献标志码：A

乙型病毒性肝炎(乙肝)是全球性的公共卫生问题之一。自1981年乙肝疫苗问世以来，疫苗的保护效果、免疫原性和安全性已得到广泛认可，但随着接种时间的延长，免疫人群的保护性抗体水平逐年下降。上海市自1986年试点推行新生儿乙肝疫苗接种工作至今已近23年，本次研究通过对上海市600名乙肝表面抗体衰减对象进行流行病学调查和细胞免疫检测，旨在探索不同免疫年限乙肝疫苗接种人群的免疫状态和乙肝表面抗体衰减的影响因素，为乙肝防治工作和免疫策略的制定提供依据。

1　对象与方法

1.1对象

采用多阶段随机抽样方法，在上海市卢湾区和松江区各随机抽取3个街道，每个街道随机抽取IlO户居民家庭，每户家庭要求抽取1名1980年以后出生、全程接种乙肝疫苗、未罹患病毒性肝炎的对象，共计600名符合条件的对象入选。经乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、抗－HBs和乙肝病毒核心抗体(抗－HBc)血清学检测，将HBsAg和抗－HBc阴性且抗－HBs

采用单纯随机抽样法，从乙肝表面抗体衰减组中随机抽取30名对象作为实验研究组，按照１：1配对原则，从人群对照组中随机抽取30名抗-HBs≥100 mIU／mL、性别相同、年龄±1岁的对象作为实验对照组。

1.2调查方法

上海市疾病预防控制中心统一制定调查问卷，内容包括调查对象的基本情况和可能导致乙肝表面抗体衰减的影响因素共18项内容。调查员由经过培训的市、区(县)疾控中心专业人员组成，采用入户调查方法收集信息。区(县)调查工作完成后，市疾控中心专业人员随机抽取10％的调查问卷，以电话方式进行质控，资料的符合率达到100％。

1.3实验方法

HBsAg、抗－HBs和抗－HBc定性检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，试剂由上海实业科华生物技术有限公司生产。阳性判断标准：HBsAg和抗－HBs的S／N≥2.1为阳性，抗－HBc抑制率≥50％为阳性。

抗－HBs定量检测采用美国雅培免疫系统，抗－HBs0～9.9 mIU／mL判为无(弱)应答，≥10 mIU／mL为保护水平，>1000 mIU／mL为强阳性。

HBV－DNA荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测采用孟德尔的HBV PCR荧光检测试剂盒，ABI 7000荧光定量PCR仪。

细胞免疫功能测定：应用胞内因子染色流式细胞检测γ－IFN和IL-4。采集肝素钠抗凝的静脉血5 mL，分离外周血淋巴细胞(PBMC)按1：1与培养液(10％灭活胎牛血清RPMI 1640)混匀，细胞浓度维持在2×106／mL，加5μL BsAg标准品混匀后，37℃，5％二氧化碳培养12h，加2μL蛋白转运抑制剂莫能霉素(Monosin，1mg／mL，Sigma公司)，培养4 h。加细胞表面染色荧光标记的单抗试剂(Human CD3，PE－Cy5，Beckman公司)室温暗处孵育15 min。加入溶血素，室温暗处孵育10min。加固定剂，室温暗处孵育15 min，离心500 g，5 min，弃上清；加破膜剂(4％的多聚甲醛PBS溶液)室温暗处孵育10 min；加入3 mLPBS洗液，离心500 g，5 min，弃上清。加入荧光标记的细胞因子抗体(Human IL－4－PE，Human γ－IFN－FITC，Beckman公司)混匀，室温暗处孵育30 min；加入3 mL PBS洗液，离心500 g，5 min，弃上清；加入500 mL PBS上流式细胞仪计数。

1.4统计分析方法

用Epiddata 3.0软件建立数据库，使用SPSS 13.0软件进行分析，分析方法包括一般性统计描述、t检验和多因素非条件Logistic回归分析。

2　结果

2.1一般情况

本次共调查600名对象，其中乙肝表面抗体衰减组293名，平均年龄为(10.61±4.78)岁，城乡分布比例为1：1.02；人群对照组307名，平均年龄为(11.70±5.82)岁，城乡分布比例为1：0.94。乙肝表面抗体衰减组和人群对照组对象的年龄和地域分布均衡可比。

2.2乙肝表面抗体衰减情况

将600名对象按免疫年限分组，抗－HBs随免疫年限的延长呈显著衰减趋势(TrendX2=93.89，P

2.3多因素非条件Logistic回归分析

以乙肝表面抗体是否衰减为因变量，将可能导致乙肝表面抗体衰减的18项影响因素作为自变量(表2)，进行多因素非条件Logistic回归分析(采用前向逐步回归，以P=0.05为纳入标准，P=0.10为排除标准)，筛选出3项影响因素，分别为免疫年限(OR=2.01，P

2.4HBV－DNA定量检测

经荧光定量PCR法检测，实验研究组30名对象的

HBV－DNA含量均为0copy／mL。

2，5细胞免疫状态比较

实验研究组对象的IFN－γ阳性细胞百分比和IL-4阳性细胞百分比显著低于实验对照组(t值分别为3.33和3.32，P均0.05)，差异无统计学意义(表4)。

3　讨论

上海市自1986年在部分区县试点推行新生儿乙肝疫苗接种策略至今已近23年，学龄前儿童的HBsAg阳性率由1992年的7.42％降至当前的1.5％，近300万名新生儿受到乙肝疫苗的保护。然而随着接种时间的延长，免疫人群的保护性抗体水平呈明显下降趋势，尤其是免疫年限超过15年的人群。

究竟是哪些因素削弱了乙肝疫苗的免疫效果。有研究发现，随着年龄增长，人体已经建立的免疫应答可随着免疫原的排出、病原体的反复刺激、神经内分泌因素的作用及免疫细胞的凋亡而逐渐被削弱。且无论初免后抗－HBs水平如何，保护性抗体的下降速率差异无统计学意义。本次研究也有相同发现，免疫年限超过15年人群的抗－HBs平均阳性率仅为22.7％，显著低于免疫年限不足15年的对象。本次研究发现，牙科治疗史与人群抗－HBs衰减现象存在密切联系，接受过牙科治疗的对象出现抗－HBs衰减的比例是未接受牙科治疗者的1.55倍。游杰等发现目前国内各类牙科诊疗器械的HBV污染率高达12，1％，且常规消毒方法的效果欠佳。青少年作为当前乙肝疫苗免疫的重点人群，因龋齿、换牙和意外伤害等原因比成年人更频繁地接受牙科治疗，规范牙科诊疗器械的消毒管理应该是减缓青少年抗－HBs衰减，保护其免受HBV侵袭的重要措施。本次研究还发现，已婚人群抗－HBs衰减率显著高于未婚人群，比值比高达13.17。但是生活中与乙肝病毒携带者密切接触(含性接触)的调查对象中却未发现抗－HBs显著衰减。推测可能因婚内性接触的使用率低于婚外性接触，HBV更容易在已婚人群中传播。对此项影响因素的研究还将进一步开展。

乙肝疫苗的保护期限有多长，是否需要加强免疫，目前国内尚无统一规范。资料显示，细胞免疫在人体清除HBV的过程中起决定性作用，Th，型淋巴细胞可分泌特异性的细胞因子抑制HBV基因表达、复制和清除肝细胞内的HBV，Th2型淋巴细胞可通过活化体液免疫应答，清除释放入外周血中的HBVtgj。众多研究者提出，乙肝疫苗接种后不需要加强免疫，因为人体接种乙肝疫苗后存在长期的免疫记忆，即使抗－HBs消退，细胞免疫应答仍能持久存在。但本次研究发现，乙肝表面抗体衰减组对象的外周血淋巴细胞经HBsAg标准品刺激后，Th，型淋巴细胞因子IFN－γ阳性细胞百分比和Th2型淋巴细胞因子IL－4阳性细胞百分比均显著低于阳性对照组，提示乙肝表面抗体衰减者清除HBV的特异性细胞免疫可能和体液免疫一样均处于弱化状态，控制乙肝表面抗体衰减的影响因素，推行乙肝疫苗加强免疫策略应该是今后乙肝防治工作的重点。