膜片钳与单细胞RT-PCR技术相结合应用于神经细胞研究的进展

[摘要] 膜片钳与单细胞RT-PCR技术相结合应用于神经细胞的研究，从电生理学和分子生物学角度揭示了神经细胞功能活动与结构之间的相互联系，使单个神经细胞离子通道的生物物理学和药理学特性得以表现，同时可以在同一细胞筛选出特异性的mRNA表达。目前，这两种技术的结合已有多方面的应用，并取得了重要的进展。

[关键词] 神经细胞；膜片钳技术；单细胞RT-PCR

[中图分类号]R34 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）04（a）-015-02

膜片钳技术(patch-clamp technique)是1976年由Neher和Sakmann[1]在电压钳基础上发展而来的一种记录细胞膜离子通道电生理活动的技术。后经Hamill[2]等进一步完善，其电流测量灵敏度已达1 PA,空间分辨率达1 m，时间分辨率达10 s，并已发展出许多适合不同需要的记录模式。它能分辨通过细胞膜单个通道的电流,对通道电导及其动力学特性、药理学特性和调节机制进行研究，为通道分型提供了可靠标准；同时它扩展了电生理技术的应用范围，以往难以研究的哺乳类动物小细胞或脆性很大的细胞等，均可采用膜片钳技术进行研究。另外，应用膜片钳技术还可准确监测出与细胞分泌相关的膜电容的微小变化，因而它还是一种研究细胞分泌机制的电生理新方法。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是一种在体外由引物介导的特定DNA序列的酶扩增，能快速特异的扩增所需目的基因或DN段，是一种用途广泛且有效的核酸扩增技术。目前，PCR技术已广泛应用于基因分离、克隆和核酸序列分析，突变体和重组体构建，基因表达调控研究及基因多态性分析等。RT-PCR是将RNA的反转录（RT）与cDNA的PCR相结合的技术。首先经反转录酶作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

膜片钳与单细胞RT-PCR相结合的目的是为了确定单细胞内多基因表达的方式。该技术应用于神经细胞的研究, 从电生理学和分子生物学角度揭示了神经细胞功能活动与结构之间的相互联系,使单个神经细胞离子通道的生物物理学和药理学特性得以表现，同时可以在同一细胞筛选出特异性的mRNA表达。

1基本原理

Eberwine等[3]于1991年首先将膜片钳与单细胞RT-PCR技术结合起来，具体方法是:将逆转录酶、dNTP(DNA合成底物)及引物等在膜片钳记录之前加到电极内液中，使细胞内mRNA在膜片钳记录过程中即被逆转录生成cDNA，然后对生成的cDNA进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行分析。这两种技术的结合可对形态相似而电活动不同的细胞做出分子水平的解释。

1995年，美国哈佛大学医学院的Sucher和斯坦福大学的Deitcher[4] 在Neuron杂志上发表文章，首次介绍了膜片钳与单细胞RT-PCR技术结合在单个神经元研究中的应用，在完成对神经元离子通道的药理学和生物物理学特性观察后，研究同一细胞上特异mRNAs的表达情况。其具体操作是:在严格防止RNA酶污染的条件下先完成全细胞膜片钳记录，再将该细胞内容物吸入到记录电极中,然后用所研究的离子通道亚单位特异性引物将取自单细胞的mRNA逆转录成cDNA后进行PCR扩增，进而检测特异的mRNA。

膜片钳技术既可以对单细胞电生理功能进行研究，又可以借助其电极形成的吸收通道，吸取单个细胞，对其进行单细胞水平的分子生物学研究。借助于膜片钳电极，在相差显微镜观察下，直接用电极将待选取的单个细胞吸取出来，将其转入Eppendorf管，然后进行RT-PCR.

2研究进展

2.1分析神经元离子通道

Srinivasan Kanumilli等[5]运用膜片钳和单细胞RT-PCR技术，对成年鼠小脑和小脑蒲肯野神经元中的CaV2.1转录本进行表达分析，发现单个小脑蒲肯野细胞虽然表达多种CaV2.1转录本，但其种类比小脑中的少。他提出不同类型的CaV2.1转录本可在不同脑区和脑神经元中进行选择性表达。Mechaly I等[6]应用膜片钳和单细胞RT-PCR研究2种不同类型哺乳动物的可兴奋细胞（海马神经元和非神经头发囊状上皮细胞），发现在这两种细胞中Nav1.2 mRNA 和Nav1.6 mRNA表达最多,而Nav1.3 mRNA 和Nav1.7 mRNA分别在胚胎海马神经细胞和新生儿的头发囊状上皮细胞有适度表达。Lidong Liu等[7]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术，在分离的2~5个月的SD雄性大鼠前舌蕈状味觉感受器细胞上研究延迟整流钾(DRK)通道的表达，发现其上有许多种来自KCNA, KCNB和 KCNC 亚家族的DRK通道，其中 Shaker Kv1.5通道(KCNA5)是蕈状味觉感受器细胞主要的DRK通道。

2.2观察神经元受体分布

Whyment等[8]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术分析新生大鼠脊髓交感神经元组胺受体mRNA的表达，观察到75％交感节前神经元表达H1受体的mRNA而未表达H2，H3和H4受体的mRNA。该研究首次报道了交感节前神经元中表达H1受体，并推测组胺通过对H1受体直接的突触后效应对交感节前神经元的兴奋性进行调节。Julia E. Fries等[9]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究增殖性玻璃体视网膜病变病人视网膜Müller 细胞中P2Y受体亚型的类型，发现Müller 细胞表达P2Y1，P2Y2，P2Y4，P2Y6受体。Sergeeva OA等[10]在急性分离的TM神经元中,运用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究AMPA受体特征。发现所有神经元上都有AMPA受体GLUR2的mRNA，75%的神经元有GLUR1的mRNA，其次是GLUR4（56%）, GLUR3（0％）。

2.3分析神经元的分子基础

Sosulina L等[11]运用膜片钳、单细胞RT-PCR及无监督聚类分析方法,依据电生理特性和分子参数的不同把大鼠侧杏仁核神经元分成五类。第一类是投射神经元，此类神经元具有低发放频率，对长期去极化刺激具有频率适应性等电生理特性并表达囊泡膜谷氨酸转运体1（VGLUT1）。其根据电紧张性的不同和是否存在血管活性肠肽（VIP）又分class IA和class IB两类。其余四类都是含有谷氨酸脱羧酶(GAD67)的中间神经元。第二类神经元产生快速棘波，并伴有一些早期的频率适应。第三类神经元无频率适应而产生快速棘波，它与第两类神经元的区别在于后者存在VIP和相对较少的神经肽Y(NPY)及生长抑素(SOM)。第四类和第五类通过分子标记不能明确区别，但可根据膜电位值和棘波图形的不同进行区分。Hüttmann K等[12]通过膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究顽固性颞叶癫痫病人的侧杏仁核神经元特性，发现投射性神经元具有棘状树突, 不同程度频率适应性的动作电位和γ-氨基丁酸受体耦联的内向整流K+通道(Kir)。而中间神经元的树突无棘或很少棘,动作电位小且常常是自发的,且无γ-氨基丁酸受体。单细胞RT-PCR发现，在投射神经元中表达Kir通道亚型Kir3.1 和Kir3.2及囊泡膜谷氨酸转运体VGLUT1和VGLUT2；而中间神经元也表达Kir通道亚型Kir3.1 和Kir3.2，但其缺乏VGLUT1 和VGLUT2受体。结果表明,根据形态学、电生理和分子生物学标准可以区分人脑杏仁核投射神经元和中间神经元。

2.4研究药物对神经细胞的作用

Zhong CB等[13]运用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术分析急性分离的东莨菪碱诱导的认知缺损的大鼠海马锥体神经元延迟整流钾电流的特征以揭示由胆碱能损伤导致记忆缺失的离子机制。他发现海马锥体神经元IK电流密度增大、振幅峰值变高；Kv2.1 mRNA增加,而Kv1.5 mRNA没有明显的改变，提示海马锥体细胞Kv2.1 mRNA表达增加可能是IK增加的原因及东莨菪碱诱导记忆缺陷的离子基础。Mark Fry等[14]应用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术分析了Adiponectin对大鼠最后区（AP）神经元的作用，观察到60％大鼠AP神经元对Adiponectin敏感，且对Adiponectin敏感的所有AP神经元均表达AdipoR1 and AdipoR2 两种Adiponectin受体。

3展望

膜片钳与单细胞RT-PCR技术相结合应用于神经科学领域的研究, 从分子生物学和电生理角度揭示了神经细胞的功能活动与结构之间的相互联系，也使得检测单个细胞的基因改变成为可能。该技术能够精确地研究特定单细胞的基因表达，成为研究功能基因组学的有力工具。而许多疾病的发生都是由于单个细胞的分子改变引起的，因此准确地找到发生改变的细胞对于疾病的诊断、机制的研究及防治都有重要的意义。但由于对技术的高度要求以及对外界干扰的高度敏感，单细胞RT-PCR 的应用受到了一定的限制。因此这项技术在体系上有待于进一步的完善，在应用上有待于进一步的扩展。

[参考文献]

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[3]Eberwine J,Yeh H,Miyashiro K,et a1.Analysis of gene expression in single Live neurons[J].PANS,1992,89:3010-3014.

[4]Sucher NJ,Deitcher DL.PCR and patch-clamp analysis of single neurons[J].Neuron,1995,14(6):1095-1100.

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（收稿日期：2007-10-16）