尾加压素Ⅱ对针刺预处理I/R损伤大鼠心肌细胞血管VEGF的影响

[摘要] 目的：研究尾加压素Ⅱ（UⅡ）在针刺抗心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法：选择健康SD大鼠120只，随机分为6组，正常对照组（A）、模型组（B）、针刺预处理组（C）、针刺+尾加压素低浓度组（20 pmol/kg）(D)、针刺+尾加压素高浓度组（60 pmol/kg）(E)和血管紧张素Ⅱ特异性受体拮抗剂（Losartan，氯沙坦）(F)，每组20只。针刺预处理组连续3 d电针预处理，第3天复制心肌缺血再灌注模型。D组、E组造模前尾静脉给药，给药后即刻造模。F组于造模前进行灌胃给药，给药后即刻造模。造模成功后常规饲养24 h，处死取材，用ELISA法测定心肌组织中的VEGF。结果：心肌缺血再灌注损伤时模型大鼠心肌组织中的VEGF含量显著升高，针刺预处理、针刺结合不同剂量UⅡ以及使用UⅡ拮抗剂均可使缺血区心肌组织中的VEGF含量降低（P

[关键词] 针刺；心肌缺血；再灌注损伤；尾加压素Ⅱ

[中图分类号] R245[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）04（a）-013-02

Effect on VEGF in myocardial cell of acupuncture pre-conditioning I/R injury rats on Urotensin Ⅱ

WANG Yue-lan, HE Lu,LONG Di-he, LI Xiao-min,WANG Ke-ming,WU Zi-jian,CAI Rong-lin,LIU Jing,ZHOU Yi-ping

(Research Center of Correlation between Meridian and Viscera, Anhui College of TCM, Hefei, 230038,China)

[Abstract] Objective:To research the effect of Urotensin Ⅱ in myocardial ischemia reperfusion injury.Methods:To select 120 healthy SD rats, divided into six groups randomly: normal group（A）,model group（B）,acupuncture precondition group（C）,acupuncture with injecting UⅡat low conditions（20 pmol/kg）(D), acupuncture with injecting UⅡat high conditions（60 pmol/kg）(E)and injecting Losartan(F),20 rats each group.Rats in C group were taken the treatment of electro-acupuncture three days continuously.In the third day, estabilished rat models of myocardial ischemia-reperfusion in the group.Rats in D, E groups were estabilished the model of myocardial ischemia-reperfusion immediately after inject UⅡ in caudalis vena. Rats in F group were received the administration of intragastric first, then be estabilished the model like D, E groups. Rats underwent a recovery period at least 24 hours after the model be estabilished successfully, used the clarified liquid to tast the content of VEGF by the method of ELASE.Results: The content of VEGF moved up in the condition of myocardium ischenmia-reperfusion injury, but in C, D, E and F groups the content of VEGF moved down（P

[Key words] Acupuncture; Myocardial ischemia; Reperfusion injury; Urotension Ⅱ

尾加压素Ⅱ(urotensin Ⅱ，UⅡ)是人体内目前已知的最强的缩血管物质，主要分布于心血管中，中枢神经系统和肾、肺、肠系膜也有少量分布。UⅡ作为机体内强有力的缩血管物质，与心肌细胞收缩功能密切相关，并呈现剂量依赖性，但其对心血管疾病的发生、发展及其在治疗中的作用目前了解仍甚少。UⅡ受体是一种孤立的G蛋白偶联受体GPR14(G-protein coupled recepter)，亦主要分布于心血管和神经系统[1~3]。UⅡ与GPR14结合后，可以引起细胞内Ca2+浓度增加，有增强细胞的功能作用。

针刺对心肌缺血不仅具有良好的治疗作用，而且有很好的预防作用。以往的研究证实，电针心经“神门”可以有效改善急性心肌缺血大鼠心功能，保护心肌细胞，抑制细胞凋亡的发生[4，5]。本研究结合中医针灸理论与现代生物医学技术，针对针刺预处理（Acupuncture Pre-condition，APC）和UⅡ及其信号转导的机制进行设计，深入探讨UⅡ在APC中作用机理，初步探索针刺预处理和尾加压素预处理在心肌缺血再灌注损伤中的作用，为阐明经脉脏腑相关实质提供科学的实验依据和基础。

1材料与方法

1.1动物

取同等条件下饲养健康SD大鼠120只，雌雄各半，体量（200±20） g，安徽全椒实验动物有限公司提供，合格证号：（苏）字Z0582号。

1.2 试剂与仪器

UROTENSIN-II（SIGMA-ALDRICH，LOT：054K4788），血管紧张素Ⅱ特异性受体拮抗剂（Losartan，氯沙坦）。BIOPAC16导生理记录仪（美国加州产，MP100A-CE）PCE－A型程控电针治疗仪（安徽天恒科技实业有限公司）；BL-220H型电子天平（SHIMADZU CORPORATCON JAPAN）；TGL-16 高速离心机（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。

1.3 动物分组

健康SD大鼠随机分为6组（按照《卫生统计学》随机数字表[6]），分别为正常组（A）、I/R模型组（B）、针刺预处理组（C）、针刺+尾加压素低浓度组（D）（20 pmol/kg）、针刺+尾加压素高浓度组（E）（60 pmol/kg）、血管紧张素Ⅱ特异性受体拮抗剂（Losartan氯沙坦）（F），每组20只。

1.4 急性心肌缺血再灌注动物模型复制和评定

模型复制前先记录正常标Ⅱ导联心电图，心电图异常者淘汰不用。大鼠用乙醚麻醉后，固定于鼠台上，沿胸骨左缘剪开皮肤，用止血钳游离大鼠左侧的胸大肌，暴露左第2、3、4肋，可以清晰地看到心脏的暗影，用弯头止血钳迅速沿胸骨左缘3、4肋间分开肋骨，挤出心脏，充分暴露心脏及其表面的血管，用4/0医用缝合线在冠状动脉前降支挂线，然后迅速将心脏送回胸腔，医用缝合线的两端留置体外备用。用长嘴止血钳把胸部皮肤和肌肉以及心脏挂线夹紧，防止气胸，观察心电图变化，T波高耸或者倒置为心肌缺血标志，如心电图改变不明显，则稍稍松一点止血钳，拉紧一端线头，这时则可以明显看到心电图改变，30 min后，再灌注时，则松开止血钳，把挂线放松，形成再灌注损伤模型。从开胸到关闭胸腔，控制在1 min以内完成。

心肌缺血和再灌注模型成功指标：心电图表现为ST段抬高和（或）T波高耸或者倒置；再灌注损伤模型成功标志，再灌注后，抬高的ST段下降50%以上或高耸的T波下降，见图1~3。

1.5 电针参数

根据以往的实验方法，选取“神门”、“内关”[7]，酒精消毒所取穴位，采用0.5寸毫针，直刺3 mm，连接PCE-A电针仪，选择刺激电压5 V，电流强度1.1 mA，2 Hz，以针体微微抖动为度，每次30 min，1次/d，电针3 d。

1.6 标本采集

模型复制成功后24 h，10％水合氯醛（0.36 ml/100 g体质量）腹腔注射麻醉大鼠，取大鼠左心室心尖部缺血区心肌组织，称重，按照19的比例加入生理盐水，匀浆，离心，选取上清液，制成10%的组织溶液，标记放入液氮冷藏保存待测。

1.7 统计处理

实验数据采用均数±标准差（x±s）表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，组间均数的两两比较采用q检验法，P

2结果

结果表明，模型组大鼠缺血区心肌组织VEGF含量显著升高，C、D、E和F组均能使心肌缺血再灌注损伤模型心肌组织缺血区的VEGF含量显著降低，D组和F组间无显著性差异，见表1。

3讨论

促血管生长因子治疗冠心病是近十年来研究热点，动物实验研究已证实 VEGF可增加冠状动脉闭塞处心肌的血流供应[8]。VEGF除了促进新血管生成外还可以减轻心肌局部I/R损伤[9]。VEGF也起着促进内皮细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用，因而是一个促进细胞生存的因素。此外，VEGF已经被证实具有促进一氧化氮(NO)合成酶和刺激释放NO的作用[10]。

屈正等[11]研究发现糖尿病早期心脏VEGF表达增加，不但可促进细胞的生存，而且促进了冠脉血管密度增加。而糖尿病慢性期时刚好相反， 刺激血管生长因子水平下降，因而心肌血管密度降低，心肌局部缺血时的灌注能力下降，细胞生存能力下降。低氧是促进 VEGF分泌的主要因素，VEGF促进血管形成作用较强，它的过度表达或表达不足很大程度影响体内血管形成。

血管新生即原有的血管又产生新的血管。生理情况下血管生长处于相对平衡状态，当发生缺血、低氧等应激情况时平衡失控，血管新生的过程被激活， 导致侧支血管形成。研究发现，心肌缺血、低氧时，冠脉侧支的形成可以减少或抵御心肌缺血或坏死，保证血液的正常供给。研究证实心肌局部缺血的动物模型和患有冠心病病人中，新血管和新毛细血管网络均增多。MARTIN A等[12]研究发现心肌局部 I/R损伤随氧耗增加或供氧减少而增加。而新血管形成有助于提高心肌组织灌注，增加心肌氧供。足够数量冠脉血管网的存在以保证缺血区域足够的血供， 是冠状动脉闭塞之后减小梗死面积甚至提供能量保证细胞生存的重要因素。

本实验结果表明，在大鼠心肌缺血30 min，再灌注24 h后，模型组的大鼠心肌VEGF表达明显高于正常组，而对模型进行干预治疗时C、D、E、F组中的心肌组织中的VEGF较B组降低，而且以D组下降最为明显，从而表明针刺结合尾加压素低剂量预处理可以明显的干预VEGF的表达，这可能也是针刺结合尾加压素预处理治疗心肌缺血再灌注损伤的作用途径之一。

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[4]Wang ke-ming，Zhou Yi-ping，Wang Yue-lan.et al.Effectofelectroa-cupuncture at different segments of heart meridian on the electric discharge activities of the superior sympathetic plexus in rabbits[J].Chinese Journal of Clinical Rehabilitation，2006，10(35)：170-171.

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[8]Sarkar N， Ruck A， Kallner G，et al. Effects of intramyocardial injection of Ph VEGF-A165 as sole therapy in patients with refractory coronary artery disease-12-month follow- up： angiogenic gene therapy[J].J Intern Med， 2001， 250(5)：373- 381.

[9]Luo Z，Diaco M，MUROHARA T，et al. Vascularendothelial growth factor attenuates myocardialischemia-reperfusion injury[J].Ann Thorac Surg，1997， 64(4)： 993- 998.

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[11]屈正，安春雷，许斌，等.血管内皮生长因子基因促进心肌血运重建的实验研究[J].中华外科杂志，2002，40(12)：951.

[12]Martin A，Komada MR，Sane DC. Abnormal angiogenesis in diabetes mellitus[J].Med Res Rev，2003，23(2)：117-145.

（收稿日期：2007-12-21）

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