血清脂质组学研究中多重离子化液相色谱―质谱方法的比较

摘 要 系统地比较了3种常用的离子化技术电喷雾电离（ESI）、大气压化学电离（APCI）、大气压光致电离（APPI）对脂类化合物的离子化效率、检测灵敏度和覆盖范围，以探讨多重离子化液相色谱质谱（LCMS）方法在血清脂质组学研究中的适用性。血清样本经甲基叔丁基醚萃取后，采用Ascentiss Express C8 色谱柱（150 mm×2.1 mm， 2.7 μm）和二元线性梯度洗脱分离，流动相（A）为乙腈水（3∶2， V/V， 含0.1%甲酸， 10 mmol/L甲酸铵），B为异丙醇乙腈（9∶1， V/V， 含0.1%甲酸，10 mmol/L甲酸铵），分别采用ESI、APCI和APPI离子源正、负离子模式进行质谱检测。结果表明，ESI离子源对脂肪酸类、甘油脂类、甘油磷脂类化合物、鞘磷脂类化合物的离子化效率最高，对异戊烯醇脂类化合物的离子化效率与APPI离子源相当，APPI离子源对胆固醇（酯）类化合物的检测灵敏度最高，APCI离子源对各类化合物的检测灵敏度均低于ESI或APPI离子源； 采用ESI和APPI离子源相结合的LCMS脂质组学分析方法可以提高分析方法的整体灵敏度和血清中脂类信息检测的完整性。

关键词 血清脂质组学； 电喷雾电离； 大气压化学电离； 大气压光致电离； 液相色谱质谱联用

1 引 言

脂类化合物是一类易溶解于有机溶剂的化合物，具有许多重要的生物学功能，参与调节多种生命活动过程，包括能量转换、物质运输、信息识别与传递、细胞发育和分化，以及细胞凋亡等[1～5]， 最近的研究表明， 脂类化合物的异常代谢与多种疾病， 如动脉硬化症、糖尿病、肥胖症、阿尔茨海默病以及肿瘤的发生发展密切相关[6，7]。研究表明， 人血清中的脂类成分具有结构多样， 浓度水平范围宽， 极性差异大等特点， 对人血清脂质组学的分析提出很大的挑战[8]。

随着软电离技术的发展， 质谱在脂质组学研究中的应用越来越广。目前脂质组学LCMS分析中常用的软电离技术包括电喷雾电离（Electrospray ionization， ESI）、大气压化学电离（Atmospheric pressure chemical ionization， APCI）和大气压光致电离（Atmospheric pressure photoionization， APPI）。ESI是基于LCMS分析技g的脂质组学研究中最常用的离子化技术[9～14]。然而， ESI也有一些不足， 如易在复杂多组分样品的检测中产生离子抑制现象。APCI主要适用于弱极性化合物， 相对于ESI不易受基质效应的影响[15，16]， 目前， LCAPCIMS技术已被应用于体液中一些脂类代谢物的检测[17， 18]。APPI适合于弱极性及非极性化合物的离子化， 相比于ESI与APCI， 其所具有的电势在一定程度上可以克服或降低离子抑制与基质干扰带来的影响[19，20]， 因而在脂类化合物定量分析中的应用越来越广泛[21～23]。有学者系统比较了ESI， APCI， APPI离子源在正相色谱条件下对脂肪酸和甘油酯类化合物的检测能力， 发现APPI离子源在检测灵敏度和定量准确性方面表现出明显的优势[24]。然而， 更值得关注的是这3种常用的离子化方法在应用更为广泛的反相色谱条件下对各种脂类化合物的检测适用性， 目前这方面的研究尚未见文献报道。本课题组在前期研究中， 基于“互补性”思路建立了应用于代谢组学的组合式离子化LCMS分析方法， 在提高代谢物的检测灵敏度和覆盖范围等方面获得良好效果[25～27]。因此， 为了探讨本方法在脂质组学分析中的应用， 本研究系统地比较了ESI， APCI和APPI离子源在反相色谱条件下对6类17种代表性脂类对照品和健康人血清中的脂类代谢物的检测能力， 为脂类化合物的质谱分析方法和脂质学研究中离子化方式的选择提供了依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Agilent 1200系列快速高分辨液相色谱仪（德国Waldbronn Aglient Technologies 公司）， 包括二极管阵列检测器、二元梯度泵、在线脱气机、自动进样器（配有恒温箱）、柱温箱； QSTARTM Elite型四极杆飞行时间串联质谱仪（美国Applied Biosystem/MDS Sciex公司）， 配有 ESI， APCI， APPI 离子源及Analyst QS 2.0数据处理系统。

17种脂质对照品（美国SigmaAldrich公司）如表1所示。乙腈、异丙醇和甲酸（色谱纯， Merck公司）： 甲酸铵（色谱纯， 美国SigmaAldrich公司）。实验用水为某品牌纯净水。

20例健康人血清样本采自中国医学科学院北京协和医院（符合中国医学科学院伦理学委员会要求）， 采集后立即于80℃冷冻保存。

2.2 色谱条件

Ascentiss Express C8 色谱柱（150 mm×2.1 mm， 2.7 μm， 德国SigmaAldrich公司）； 流动相： A相为乙腈水（3∶2， V/V， 含0.1%甲酸， 10 mmol/L甲酸铵）； B为异丙醇乙腈（9∶1， V/V， 含0.1%甲酸， 10 mmol/L甲酸铵）。线性梯度洗脱条件： 0～1.5 min， 32% B； 1.5～18.5 min， 32%～97% B； 18.5～22 min， 97% B。每次进样前， 色谱柱在初始流动相下平衡5 min。流速： 300 μL/min； 柱温： 55℃； 进样量： 10 μL。

2.3 质谱条件

采用正、负离子全扫描模式， 扫描范围为120～2000 Da。ESI离子源喷雾电压为4 kV/4 kV， APCI离子源放电电流为2.5 μA/2.5 μA， APP离子源电离电压为1.2 kV/1.2 kV。ESI， APCI， APPI离子源温度分别为450℃、420℃、400℃， 雾化气： 0.41 MPa， 干燥气： 0.34 MPa， 气帘气： 0.21 MPa。APPI离子源中掺杂剂丙酮的流速为20 μL/min， VWD灯保护气流速为1 L/min。实验所用气体均为氮气。数据采集及处理软件采用Analyst QS 2.0数据处理系统。

2.4 对照品溶液及血清样本的制备

2.4.1 脂类对照品混合溶液的配制 分别称取适量17种对照品， 分别溶于CH2Cl2CH3OH（2∶1， V/V）混合溶液中， 制备脂类对照品贮备液， SA、SM（d18∶1/16∶0）、PE（14∶0/14∶0）、CoQ10贮备液的浓度为0.1 mg/mL， 其余均为1 mg/mL。取适量脂类对照品贮备液， 用乙腈异丙醇水（65∶30∶5， V/V）稀释并定容至5 mL， 配制成各种脂类化合物浓度均为3 μg/mL的对照品混合溶液。

2.4.2 血清样本前处理 实验前将血清样本在4℃下解冻， 取血清30 μL， 加入甲醇200 μL， 甲基叔丁基醚660 μL， 涡旋混合5 min， 加入水150 μL， 涡旋5 min后静置5 min， 4000 r/min离心5min后移取上层有机相500 μL并吹干， 残留物用500 μL乙腈异丙醇水（65∶30∶5， V/V）混合溶剂复溶， 15000 r/min离心10 min后进样分析。

2.5 数据处理方法

取20例血清样本经LCMS分析后获得原始数据文件， 利用数据格式转换软件 （Wiff to mzData， version 1.0.0.4， Applied Biosystems/MDS Sciex） 将原始数据文件转换为mzData格式， 用XCMS进行保留时间校准、峰识别、滤噪、峰匹配， 获得包含质荷比、保留时间、峰面积等信息的原始数据矩阵。采用CAMERA （Collection of Algorithms for Metabolite Profile Annotation）软件标注， 并手动剔除加合离子、同位素离子以及碎片离子峰。采用自编的程序对3种离子源获得的离子峰进行比较， 设定质荷比与保留时间的容许偏差值（m/z=0.05， RT=0.2 min）， 即代谢物保留时间偏差在0.2 min以内、质量数偏差

3 结果与讨论

3.1 3种离子化技术对脂类化合物对照品的离子化特点

采用ESI， APCI， APPI 3种离子源对不同种类的脂类化合物对照品的混合溶液进行了LCMS分析， 详细考察了3种离子源的离子化特点， 结果见表2。脂肪酸类化合物在3种离子源负离子条件下均易离子化。甘油脂类化合物在正离子检测模式下易离子化， 离子化过程中容易发生中性丢失而脱去水或脂肪酸分子， 所产生的[M+H-H2O]+和[M+H-RCOOH]+ 离子的相对丰度在APPI离子源中最高、其次是APCI离子源， 在ESI离子源中最弱（图1）。甘油磷脂和鞘磷脂类化合物在（±）ESI模式下均易离子化， 但在正离子模式下的离子化效率高于负离子模式。而APPI和APCI离子源条件下， 甘油磷脂和鞘磷脂类化合物的磷酯键容易断裂， 形成多种丰度较低的碎片离子。胆固醇（酯）类化合物在3种离子源正离子模式下均易脱去水分子或脂肪酸分子而被离子化。异戊烯醇脂类化合物易在正离子模式下发生离子化， 在3种离子源中均形成[M+H]+的基峰离子。

综上所述， ESI离子源的离子化能力最强， 适用于大多数脂类化合物。相对于APCI和APPI离子源， ESI离子源是最温和的离子化技术， 除能产生 [M+H]+离子外， 还常产生相对丰度较高的[M+NH4]+， [M+Na]+等加合离子； 而APPI和APCI离子源条件下， 脂类化合物尤其是磷脂类化合物容易发生碎裂而得不到准分子离子。

3.2 3种离子化技术对脂类对照品的检测灵敏度

脂类对照品混合液依次连续进样6次， 采用优化后的质谱条件进行LCMS分析， 根据不同离子源的离子化特点， 分别选择各种脂类化合物在各种离子源离子化时产生的基峰离子， 提取相应的离子流色谱峰， 计算平均峰面积。 结果（图2）表明， 17种脂类对照品在相同浓度下表现出明显不同的离子化效率。ESI离子源不但对较易离子化的脂肪酸类、甘油磷脂类、鞘磷脂类代谢物的离子化能力最高， 对极性较小的甘油二酯和甘油三酯类化合物的离子化效率也优于APCI和APPI离子源。推测是由于流动相中的甲酸铵能促进该类化合物形成[M+NH4]+离子而发生离子化。实验中发现， 当流动相中不加入甲酸铵等添加剂时， 这些[M+NH4]+离子的强度显著降低， 导致该类化合物在（+）ESI条件下的离子化效率显著低于（+）APCI和（+）APPI。这一结果与文献[24]中正相色谱条件下获得的结果一致。ESI离子源对异戊烯醇脂类化合物的检测灵敏度与APPI离子源相当， 均优于APCI离子源。APPI离子源对胆固醇（酯）类化合物检测能力最强， 显著高于APCI和ESI离子源。APCI离子源对各类化合物的检测能力均低于ESI或APCI离子源。

3.3 多重离子化LCMS技术在血清脂质组学分析中的适用性

分e采用ESI、APCI、APPI离子源正、负离子检测模式对20例健康人的血清样品进行了LCMS谱分析， 典型色谱图见图3， 同一样品在不同离子源条件下的LCMS总离子流色谱图具有明显差异。ESI离子源对不同保留时间的脂类代谢物均有良好的响应。APCI和APPI离子源检测获得的色谱峰在保留时间8～13 min的区域强度较低， 这与这一区域的化合物主要是磷脂类代谢物有关。在保留时间15～18 min的区域（主要是甘油三酯、固醇酯和异戊烯醇脂类）， ESI、APCI和APPI离子源均具有良好的响应。这些结果与之前采用对照品分析获得的结果一致。

为了进一步比较3种离子源对血清中脂类成分检测的适用性， 我们对LCMS分析获得的色谱峰进行了提取， 比较了各种离子源所能检测到的色谱峰的数目以及每种离子源所检测到的特有色谱峰和共有峰（图4）。从图4可见， 正离子模式下3种离子源检测到色谱峰的总数为1684个， ESI、APCI、APPI离子源分别检测到1445， 274， 613个色谱峰， 分别为色谱峰总数的86%、 16%、 36%； 负离子模式下3种离子源检测到色谱峰的总数为822个， ESI， APCI， APPI离子源分别检测到762， 91， 122个色谱峰， 分别占色谱峰总数的93%、 11%、 15%。（+）ESI和（+）APPI检测到的色谱峰数目占到3种离子源正离子模式下检测到色谱峰总数目的99%， （-）ESI和（-）APPI检测到的色谱峰数占3种离子源负离子模式下检测到色谱峰总数的98%。APCI离子源在正负离子模式下检测到的色谱峰数目均少于APPI离子源， 其中大多数共有峰的响度强度均低于APPI离子源。上述结果表明， ESI离子源对血清中脂类代谢物检测的覆盖范围最大， 其次是APPI离子源， APCI离子源的检测能力最弱。

4 结 论

本研究采用ESI， APCI和APPI 3种不同离子化技术的LCMS分析方法， 分别对6类17种脂类对照品及20例健康人的血清样本进行了系统分析比较。结果表明， ESI离子源对血清中脂类代谢物的检测能力最强， APPI离子源可以对ESI离子源提供很好的补充， 而APCI离子源所能提供的信息有限。采用ESI和APPI离子源相结合的LCMS脂质组学分析方法可以提高分析方法的整体灵敏度， 有利于从复杂生物样本中获得更完整的脂类代谢物信息。

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