黄芪注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠MMP-9和IL-1β的影响

摘要 目的：观察黄芪注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠MMP-9及IL-1β的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤保护作用的机制。方法：采用大脑中动脉局灶性栓塞（MCAO）模型，干湿比重法检测脑含量，免疫组化法检测脑组织MMP-9的表达，ELISA法检测脑组织IL-1β的含量。结果：与模型组相比，黄芪注射液可显著降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织MMP-9和IL-1β的表达及含水量。结论：黄芪注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠有明显的抗炎和减轻水肿的保护作用。

关键词 脑缺血再灌注 黄芪注射液 脑水肿 MMP-9 IL-1β 大鼠

脑缺血后脑组织发生水肿，其发生机制还没有完全被解读，而脑缺血后炎性反应在脑水肿中扮演的角色越来越受到人们的重视。黄芪具有补气益气功效,已经广泛应用到脑缺血患者的治疗中。主要是因为它具有有通脉作用，但其在降低炎性反应，减轻脑水肿中的作用研究较少。故本实验主要研究黄芪注射液在脑缺血再灌注损伤的抗炎作用及其对脑水肿的影响。实验主要检测脑组织基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及白介素-1β（IL-1β）表达和脑含水量的变化，探索黄芪注射液对脑缺血再灌注损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：均为健康清洁级SD大鼠，雄性，每组10只，体重280±10g，购自动物实验中心，动物实验合格证：SYXK（浙）2008-0115。术前禁食不禁水12h。

1.2 试剂与仪器：黄芪注射液：成都地奥九泓制药厂，批号：0809032。TU-1900双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。兔抗鼠MMP-9抗体、过氧化物酶标记的羊抗兔IgG：武汉博士德公司。大鼠IL-1β Beta ELLSA试剂盒：北京富众科技发展有限公司。

1.3 模型制备：大鼠称重后用10%水合氯醛（0.4ml/100g体重）腹腔麻醉,按照Ludmila Belayev［1］的方法，在颈正中切开并暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉及其分支，结扎并剪断颈外动脉。用动脉夹暂时阻断颈总动脉，在距颈总动脉分叉0.8~1.0cm处用双重丝线结扎颈外动脉，在颈外动脉近心端将多聚赖氨酸处理的4-0(直径0.26mm)尼龙线从小口经分叉处轻轻推入颈内动脉，当插入距颈总动脉分叉约2.0cm处并有轻微阻力，表明已阻塞了大脑中动脉主干的起始部。随后在颈外动脉插入的近心端用丝线结扎。假手术组尼龙线只插入0.5cm左右。经60min缺血后，将尼龙线抽出，扎紧切口，松开颈总动脉的动脉夹，行再灌注。手术过程保持大鼠肛温在37～38℃，并维持至动物麻醉苏醒。模型成功标志：①提尾时左前肢内收屈曲;②同侧Homer征(即同侧眼球下陷,眼裂变小);③爬行时向左侧转圈。不符合标准的动物剔除。

1.4 分组与给药：将30只SD大鼠随机分为3组，即假手术组、模型组、黄芪组。黄芪组于造模后第二天开始腹腔注射黄芪注射液（5.0ml/kg），连续3d，假手术组、模型组按同样方法腹腔注射等量生理盐水。

1.5 检测指标与方法：分述如下。

1.5.1 脑含水量测定：于第3d行为学评价结束后用10%水合氯醛（0.4ml/100g体重）腹腔注射麻醉,心脏灌流后，断头取脑，低温下取血肿中心前半分区脑组织,准确称重置于(100～110)℃的烤箱中烘24h至恒重后,称取干重,根据公式:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重来计算,精确度为0.01。

1.5.2 MMP-9的表达：同上法低温下取出脑组织靠枕叶的1/2脑组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，用于免疫组化测定MMP-9表达。

1.5.3 IL-1β的表达：同上法低温下取出脑组织靠枕叶的1/2脑组织，称重后按重量体积比加生理盐水制备成10%的组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清，-80℃冰箱保存待用。脑组织中IL-1β测定用ELSA法。分别按照各试剂盒说明书操作。

1.6 数据处理：数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS11.5统计软件one-way ANOVA进行方差分析。

2 结果

2.1 脑含水量变化：详见表1。假手术组与模型组比较，模型组脑组织含水量明显升高，有统计学差异（P

2.2 脑组织MMP-9表达变化：见表2。假手术组大鼠脑组织MMP-9阳性细胞表达极少，模型组表达明显增加，两者有统计学差异（P

2.3 脑组织中IL-1β含量变化：

见表3。假手术组大鼠脑组织IL-1β的含量与模型组比较明显升高，两者有统计学差异（P

3 讨论

MMPs(基质金属蛋白酶类)是一组与锌结合、分解胞外基质的蛋白酶，参与胚胎发育及组织重塑，并在多种病理过程中发挥作用，如炎症反应、恶性肿瘤浸润、动脉粥样硬化、脑血管病等［2］。MMP-9是MMPs家族成员之一,是一种糖蛋白，可由中性粒细胞、单核细胞、血管内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等多种细胞分泌。近年越来越多的证据表明，炎症反应时多种细胞因子可上调MMP-9表达。同时，MMP-9又对许多促炎因子发挥正反馈作用，是炎症反应重要的“调节剂”［3］。脑缺血后，活化的MMP-9通过对富含基底膜的毛细血管床过度降解而使血脑屏障开放，炎症细胞和因子侵入。同时，炎症细胞和因子的浸润又刺激MMP-9的表达，导致神经系统损伤进一步加大［4］。MMP-9表达增加，导致基底膜破坏，血脑通透性增加，脑水肿加重，故抑制或降低MMP-9的表达可以起到减轻脑水肿的作用。

IL-1β在介导炎症反应中起重要作用。IL-1β是一种具有多效性作用的促炎性细胞因子，是启动炎症反应的关键细胞因子之一，在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用。IL-1β在脑缺血再灌注损伤中的作用机制主要有以下几个方面：①IL-1β可增加缺血组织兴奋性氨基酸的神经毒性；②IL-1β可增加脑缺血神经细胞Ca2+超负载，加速脑神经细胞损伤；③IL-1β可刺激内皮细胞表达白细胞黏附因子、白细胞介素-8，促使白细胞游出血管聚集在缺血脑组织，加重脑缺血损伤；④可诱导神经元凋亡基因的表达，促使细胞凋亡，造成缺血后梗死和神经功能损害［5］。此外，IL-1β可通过促进白细胞和内皮细胞黏附而激发炎症反应，破坏脑毛细血管内皮细胞和基底膜，血脑屏障损害导致血管源性水肿，加重继发性脑损伤。故抑制或降低脑组织IL-1β的含量，可以减轻脑水肿。

本实验结果显示，脑缺血再灌注大鼠脑组织中IL-1含量和MMP-9表达明显增加，同时脑含水量明显增加，说明脑缺血再灌注损伤后伴有明显的炎性反应。炎性反应加重脑水肿。黄芪注射液能降低脑缺血再灌注损伤脑组织IL-1β的含量和MMP-9的表达，从而减轻脑水肿，表明黄芪注射液可通过减轻炎性反应，减轻脑水肿，发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。

4 参考文献

［1］Ludmila Belayev, Ofelia FA, Raul B, et al.Middle Cerebral Cortery Occlusion in the rat by intraluminal［J］.Suture stroke,1996，27(9)：1612.

［2］Gasche Y，Copin JC，Sugawara T，et al.Matrix metalloproteinase inhibition prevents oxidative stress－associated blood-brain barrier disruption after transient focal cerebral ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2001，21(12):1393-1400.

［3］Gu Z, Cui J, Brown S, et al.A highly specific inhibitor of matrix metalloproteinase-9 rescues laminin from proteolysis and neurons from apoptosis in transient focal cerebral ischemia［J］.J Neurosci，2005,25 (27):6401-6408.

［4］吴家幂,刘胜达.实验性大鼠脑出血后脑组织MMP-9的表达及其意义［J］.放射免疫学杂志,2005,18(5):391-393.

［5］FotheringhamA P , Davies C A , Davies L.Oedema and glial cell inv2 olement in the aged mouse brain after permanent focal ischaemia［J］.Neuropathol Appl Neurobiol , 2000 ,26 (5) :412.

收稿日期 2010-08-19