萝卜CBPs溶菌酶活性的稳定性研究

摘要：植物溶菌酶是植物防御体系中的一部分，在植物防卫体系中具有重要作用。萝卜中有2个具溶菌酶活性的几丁质结合蛋白（Chitin-binding proteins，CBPs），分别是CBP1、CBP2组分。为了解CBPs的作用机制以及在萝卜中的生理功能，试验研究了CBP1、CBP2溶菌酶组分酶活性的稳定性。结果显示，CBP1、CBP2在pH 5.4、65 ℃条件下迅速失活，在pH 3.4～10.6、25 ℃条件下较稳定；CBP1较CBP2对氧化剂H2O2、NaClO敏感；CBP2较CBP1对木瓜蛋白酶敏感；2个组分对胰蛋白酶均敏感。

关键词：萝卜；溶菌酶活性；几丁质结合蛋白；稳定性

中图分类号：S631.1；Q556+.2；Q946.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1330-04

溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）广泛存在于生物体内，是一类专门作用于微生物细胞壁的水解酶，有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤，增强免疫力等作用，已在医学、食品、化妆品、生物工程等多个领域得到广泛应用[1]。对于溶菌酶的发现是从Nicolle 1907年发表枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）溶解因子的报告开始的[1]；而对于溶菌酶本质的研究则是在1922年Fleming等[2]发现人的鼻涕、唾液、眼泪具有较强的溶菌活性、并把起溶菌作用的因子命名为溶菌酶后开始的[3]。在众多研究中，鸡蛋清的溶菌酶（Hen-egg white lysozyme，HEWL）含量多，制备技术较成熟，所以研究较深入[4]。现在植物溶菌酶的研究也取得了很大进展，研究者们已经先后从无花果（Ficus carica L.）[5]、芜菁（Brassica rapa L.）[6]、苋菜（Amaranthus mangostanus L.）[7]、花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）等植物的组织中及番木瓜（Carica papaya L.）[8]、大牛角瓜[Calotropis gigantea（L.）W. T. Aiton][9]、三叶橡胶树[Hevea brasiliensis（Willd. ex A. Juss.）Muell. Arg.][10]、冠状狗牙花[Ervatamia coronaria（Jacq.）Stap f.][11]、叙利亚马利筋（Asclepias syriaca L.）[12]等植物的乳汁中和萝卜（Raphanus sativus L.）[13]块根组织中提取到了溶菌酶；萝卜组织中有2个具有溶菌酶活性的几丁质结合蛋白（Chitin-binding proteins，CBPs）组分，业界分别表述为CBP1、CBP2；其对进一步了解植物溶菌酶的作用机制和拓展植物溶菌酶的应用范围具有一定的研究价值。为了弄清楚CBPs的作用机制以及在萝卜中的生理功能，试验探讨了CBPs溶菌酶活性在不同环境条件下的稳定性。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

萝卜取自华南农业大学生命科学学院网室栽培的新鲜萝卜块根；溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）采用美国Sigma公司产品；木瓜蛋白酶液自行配制，由1份木瓜蛋白酶加9份激活剂组成，激活剂含2 mmol/L乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、20 mmol/L半胱氨酸（Cysteine，Cys）；胰凝乳蛋白酶（100 μg/mL）和胰蛋白酶（10 mg/mL）由华南农业大学生命科学学院中心实验室提供；不同pH的磷酸缓冲液自行配制，H2O2、NaClO等为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 具溶菌酶活性的CBPs分离及纯化 参照文献[13]的方法，将萝卜块根洗净、捣碎、离心、取上清，脱氨、再生、几丁质凝胶亲和层析、羧甲基纤维素层析柱离子交换层析，结果从萝卜块根中分离到2个具溶菌酶活性的酶组分CBP1和CBP2，分别将两者冷冻干燥，得到粉末状物质，可视为试验所需的酶粉。

1.2.2 CBPs溶菌酶活性测定 取2个酶组分的酶粉，在25 ℃环境下，用pH 5.4、50 mmol/L的磷酸缓冲液溶解，配成2个酶组分的酶液，待用。参照文献[13]的方法。用pH 6.2、50 mmol/L 磷酸缓冲液配制溶壁微球菌悬浮液，在30 ℃条件下取2.5 mL上述悬浮液于比色杯中，分别加入0.1 mL的2个酶组分酶液，迅速搅匀，以每分钟在450 nm处使吸光度值下降0.001所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

1.2.3 CBPs溶菌酶活性的酸碱稳定性 取2个酶组分的酶粉，用不同pH的50 mmol/L磷酸缓冲液（pH 2.2～10.6、25 ℃）溶解，放置30 min，分别测定CBP1、CBP2组分的溶菌酶活性，比较2个酶组分之间的酶相对活性。

1.2.4 CBPs溶菌酶活性的热稳定性 2个酶组分的酶粉用pH 5.4的50 mmol/L磷酸缓冲液溶解，在不同温度（0～80 ℃）下放置30 min，流水冷却，分别测定CBP1、CBP2组分的溶菌酶活性，比较2个酶组分之间的酶相对活性。

1.2.5 CBPs溶菌酶活性在氧化剂H2O2、NaClO中的稳定性 2个酶组分的酶粉用pH 5.4的50 mmol/L磷酸缓冲液溶解，分别加入不同终浓度的H2O2（分别配制成5、10、15、20、25 mmol/L梯度溶液）或NaClO（分别配制成5、10、15、20、25、30、35 μg/mL梯度溶液），25 ℃放置30 min，再分别测定CBP1、CBP2组分的溶菌酶活性，比较2个酶组分之间的酶相对活性。

1.2.6 CBPs溶菌酶活性对蛋白酶的稳定性 分别在1 mL 2个酶组分酶液中加入1 mL木瓜蛋白酶液，37 ℃水浴10 min后分别测定CBP1、CBP2组分的溶菌酶活性；分别在1 mL 2个酶组分酶液中加入胰凝乳蛋白酶（100 μg/mL）或胰蛋白酶（10 mg/mL），经30 min后分别测定CBP1、CBP2组分在一定时间范围（60 min）内的溶菌酶活性，比较2个酶组分之间的酶相对活性。

2 结果与分析

2.1 CBPs溶菌酶活性的酸碱稳定性

CBPs溶菌酶活性的酸碱稳定性测定结果见图1。从图1可见，在pH 2.2～pH 3.4时，CBP2溶菌酶组分的相对活性升幅小，而CBP1溶菌酶组分的相对活性升幅大；在pH 3.4～pH 10.6时，2个CBPs溶菌酶组分的相对活性都比较稳定；但在pH>10.6时，2个CBPs溶菌酶组分的相对活性迅速降低。

2.2 CBPs溶菌酶活性的热稳定性

CBPs溶菌酶活性的热稳定性测定结果见图2。从图2可见，在pH 5.4、0～55 ℃范围内，CBPs溶菌酶活性对温度不太敏感；60 ℃时，CBP1溶菌酶组分的酶相对活性迅速降低，CBP2溶菌酶组分仍残余75%的酶相对活性。继续升高温度到65 ℃，则2个CBPs溶菌酶组分的酶相对活性都急剧下降至0。

2.3 氧化剂对CBPs溶菌酶活性的影响

氧化剂对CBPs溶菌酶活性的影响结果见图3。从图3A可见，2个CBPs溶菌酶组分的酶相对活性对NaClO都很敏感，尤其是CBP1溶菌酶组分。从图3B可见，H2O2对2个CBPs溶菌酶组分的酶相对活性影响呈现明显的差异：其中CBP1溶菌酶组分的酶相对活性在H2O2中不稳定；CBP2溶菌酶组分的酶相对活性在低浓度的H2O2中稳定，当H2O2浓度升高至24 mmol/L时，则酶相对活性迅速下降至41%。

2.4 蛋白酶对CBPs溶菌酶活性的影响

蛋白酶对CBPs溶菌酶活性的影响结果见图4。从图4A可见，木瓜蛋白酶对2个CBPs溶菌酶组分的酶相对活性的影响差异明显；随着作用时间的增加，CBP1溶菌酶组分的酶相对活性出现先上升后下降的趋势，CBP2溶菌酶组分的酶相对活性变化趋势为迅速下降至8.7%。胰凝乳蛋白酶对CBPs溶菌酶活性无明显的作用（所以结果未显示）。从图4B可见，胰蛋白酶对CBPs溶菌酶组分的酶相对活性的影响结果是随着作用时间的增加表现明显，如作用60 min后CBP1和CBP2溶菌酶组分的酶相对活性均下降至20%左右。

3 讨论

溶菌酶是一种碱性蛋白质，大部分溶菌酶在酸性条件下比较稳定，对热不稳定，如大麦溶菌酶在pH 4.0、60 ℃以上的环境里急速失活；鸡蛋清溶菌酶在pH 3.0时能耐受100 ℃高温达45 min之久[14，15]。试验进行的萝卜CBPs溶菌酶活性的热稳定性、酸碱稳定性研究得到了类似的结果，都是在pH 5.4、65 ℃时迅速失活，而常温下在pH 3.4～10.6范围都较稳定。

Meyer[16]研究发现，在酸性条件下用N-溴代琥珀酰亚胺（N-bromosuccinimide，NBS）、氯化碘（ICl）均可氧化鸡蛋清溶菌酶的色氨酸（Tryptophan，Trp），CBPs溶菌酶活性对NaClO（0.003%）也很敏感，专一性化学修饰剂NBS证明Trp是CBP2溶菌酶组分活性中心的必需氨基酸残基，故有可能是氧化剂NaClO与Trp形成了复合物的缘故。李培峰等[17]在研究H2O2对Cu・Zn-超氧化物歧化酶活力的影响时发现：随着H2O2浓度的升高及作用时间的增加，Cu・Zn-超氧化物歧化酶的活力下降；进一步的研究发现，还会使组氨酸（Histidine，His）含量减少，天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）、谷氨酸（Glutamic acid，Glu）增加。而萝卜CBPs对H2O2较敏感，使用专一性化学修饰剂证明Asp/Glu和His可能是溶菌酶活性中心的氨基酸残基，增加Asp、Glu可能会改变活性中心的构象，或者能减少His对活性的破坏作用[18]。

木瓜蛋白酶是一种多酶混合物，其中的各种酶之间相互协同，故水解蛋白质的能力强。对于CBP1溶菌酶组分而言，可能由于刚加酶液时，活性中心处于木瓜蛋白酶分子达不到的溶菌酶组分分子的内部，此时木瓜蛋白酶并不降解活性中心，反而通过降解其他部位的赖氨酸（Lysine，Lys）、精氨酸（Arginine，Arg）的C-末端，使得分布在各肽段活性中心的构象变成更加适合底物溶壁微球菌的结合降解。随着时间的推移及构象的变化，会使活性中心暴露，木瓜蛋白酶将活性中心的Glu、Asp降解，破坏了活性中心，故酶活力减弱；而对于CBP2溶菌酶组分来说，可能由于酶活性中心处于易被蛋白酶水解的位置，故加入木瓜蛋白酶后其活性中心马上被降解，酶活性迅速降低，其对木瓜蛋白酶的敏感程度远大于CBP1。胰蛋白酶对CBPs溶菌酶活性的影响是随着作用时间的增加体现出来的，CBP1和CBP2溶菌酶组分的活性对胰蛋白酶均为敏感。

综上所述，萝卜CBPs的稳定性存在差异：CBP2溶菌酶组分对酸及在pH 5.4时对热较CBP1稳定，对木瓜蛋白酶较CBP1溶菌酶组分敏感；CBP1对氧化剂H2O2、NaClO较CBP2敏感。这种稳定性的差异可能与CBPs氨基酸序列及溶菌酶活性中心的构象差异有关。

参考文献：

[1] 丁亦男，聂洪峰.溶菌酶的应用进展[J]. 长春师范学院学报（自然科学版），2009，28（6）：46-47.

[2] FLEMING A， ALLISON V D. A bacteriolytic substance（“Lysozyme”） found in secretions and tissues [J]. Brit J Exptl Pathol，1922，5：252.

[3] （日）船津 胜，鹤 大典.溶菌酶[M].李兴福，译.荆永志，校.济南：山东科学技术出版社，1982.

[4] 惠秋沙.溶菌酶的研究进展及优势分析[J]. 中国健康月刊，2011，30（5）：326-327.

[5] GLAZER A N， BAREL A O， HOWARD J B， et al. Isolation and characterzation of fig lysozyme[J]. J Biol Chem，1969， 244（13）：3583-3589.

[6] BERNIER I， VAN LEEMPUTTEN E. The turnip lysozyme [J]. FEBS Lett，1971，14：100.

[7] CHERKASOV I A， KRARCHENKO N A， KAVERNEZA E D. Isolation and purification of lysozyme by fractionation on a chitin-containing column [J]. Mol Biol，1967，1（1）：41-46.

[8] HOWARD J B，GLAZER A N. Papaya lysozyme[J]. J Biol Chem，1969，244（6）：1399-1409.

[9] SHUKLA O P. Lysozyme from the latex of Calotropis procera [J].Biol Mem，1985，11（2）：182-191.

[10] MARTIN M N. The latex of Hevea brasiliensis contains high levels of both chitinase and chitinase/lysozyme[J]. Plant Physiol，1991，95：469-476.

[11] KIDWAI A M， KRISHNA MURTI C R. Purification and properties of a bacteriolytic enzyme from the latex of Ervatania coronaria [J]. India J Biochem，1963，6：177.

[12] LYNN K R. Lysozymes from latex of Asclepias syriaca[J].Phyto Chem，1989，28（5）：1345-1348.

[13] 赖晓芳，蔡发国，王炜军，等.萝卜块根中两个具溶菌酶活性的几丁质结合蛋白的纯化及其特性[J].植物生理与分子生物学学报，2006，32（4）：445-450.

[14] 李冬梅.溶菌酶及在食品中的应用[J].食品工业，1999（3）：21-22.

[15] 刘 慧，王凤山，楚 杰.蛋清溶菌酶部分酶学性质及酶活性的影响因素研究[J].中国生化药物杂志，2008，29（6）：385-387.

[16] MEYER K， HAHNEL E，STEINBERG A. Lysozyme of plant origin[J]. J Biol Chem，1946，163（3）：733-740.

[17] 李培峰，方允中.过氧化氢对铜锌超氧化物歧化酶活性及某些理化性质的影响[J].生物化学杂志，1993，9（4）：411-416.

[18] 赖晓芳，沈善瑞，王炜军，等.萝卜中具溶菌酶活性组分的分子结构分析[J].安徽农业科学，2012，40（27）：13267-13269.