美罗培南无菌检查的方法学验证

[摘要] 目的 建立美罗培南的无菌检查标准方法。 方法 根据中国药典2010年版附录Ⅺ H无菌检查法中的要求，采用薄膜过滤法进行方法学验证。 结果 每筒冲洗量600 ml（分6次），人工振荡，可以消除样品对6株实验菌的抗菌活性。 结论 美罗培南采用薄膜过滤法，总冲洗量为1800 ml，采取人工振荡，可以用大肠埃希菌作为阳性对照菌进行无菌检测。

[关键词] 美罗培南；无菌检查；方法学验证；薄膜过滤

[中图分类号] R978.1+1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）12（a）-0068-03

美罗培南属于碳青霉烯类抗生素，通过抑制细菌细胞壁的合成而产生抗菌作用[1]，在临床中应用广泛[2]，其具有对多种β-内酰胺酶稳定及抗菌谱广的特点[3-4]。在建立药品的无菌检查法时，应进行方法学验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查[5]。本文按照《中国药典》2010版的有关要求，通过接种代表性的阳性菌株[6]，采用薄膜过滤法，进行人工振荡及改变冲洗次数，对3个批次的美罗培南进行反复实验，以期找到消除美罗培南抗菌活性的方法和实验条件，建立相应的无菌检查法，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 仪器

HTY-K型振荡仪、高得泰林Htysteritest601型集菌仪、KDGB330全封闭式集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）。

1.2 样品

美罗培南（批号：05001、05002、05003）为石药集团中诺药业生产。

1.3 试剂

硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、pH 7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基。

1.4 菌种

中国药品鉴定所提供的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。

1.5 方法

按中国药典2010版附录Ⅺ H无菌检查法，采用薄膜过滤法[7-8]。

1.5.1 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35 ℃培养18～24 h；接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35 ℃培养18～24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28 ℃培养24～48 h；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数

1.5.2 菌液计数

分别取上述4种细菌菌悬液1 ml加入无菌培养皿中，注入15～20 ml温度≤45 ℃溶化的营养琼脂培养基，混匀，30～35 ℃培养48 h后计数（生孢梭菌应在无氧环境培养）。分别取上述2种真菌菌悬液1 ml加入无菌培养皿中，注入15～20 ml温度≤45℃溶化的玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，23～28 ℃培养72 h后计数。每种菌悬液平行做2个平板。

1.5.3 制备供试液

取美罗培南3 g，将其无菌转移到500 ml的0.023%无菌碳酸钠溶液中，摇匀作为供试液。同法制备数份备用。

1.5.4 验证实验-薄膜过滤法

重复以下操作，直至做完3批样品。

1.5.4.1 实验组 ①安装好集菌器，将少量无菌pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液通过集菌仪过滤，以润湿滤膜。②将制备好的供试液500 ml通过集菌仪过滤，均匀分散在集菌器3个滤筒中，边过滤边振荡。③用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每筒每次冲洗量约100 ml，共冲洗5次，边冲洗，边振荡（手摇振荡）。④按上述方法共制备6个滤筒，每个滤筒在最后100 ml冲洗液中逐一加入97 CFU的金黄色葡萄球菌、55 CFU的大肠埃希菌、46 CFU的生孢梭菌、52 CFU的枯草芽胞杆菌、50 CFU的白色念珠菌、52 CFU的黑曲霉。⑤在4个加有细菌的滤筒中分别加入100 ml硫乙醇酸盐流体培养基，置于30～35 ℃培养5 d，逐日观察结果；在2个加有真菌的滤筒中分别加入100 ml改良马丁培养基，置于23～28℃培养5 d，逐日观察结果。⑥按上述方法操作，做冲洗6次的实验。

1.5.4.2 阴性对照组 取集菌器1套，通过集菌仪将1瓶pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液过滤，在1个滤筒中加入100 ml硫乙醇酸盐流体培养基，置于30～35 ℃培养室，培养5 d，无菌生长；在1个滤筒中加入100 ml改良马丁培养基，置于23～28 ℃培养室，培养5 d，无菌生长。

1.5.4.3 阳性对照组 制备4个装有100 ml硫乙醇酸盐流体培养基的滤筒，逐一加入与实验组等量的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽胞杆菌，置于30～35 ℃培养5 d，逐日观察结果；制备2个装有100 ml改良马丁培养基的滤筒，逐一加入与实验组等量的白色念珠菌、黑曲霉，置于23～28 ℃培养5 d，逐日观察结果。

2 结果

2.1 验证用微生物的计数结果

在实验中可采用金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的稀释级别分别为10-6、10-7、10-5、10-5、10-5、10-5时，可满足药典要求，具体计数结果见表1。

2.2 阴性对照组微生物培养的结果

阴性对照组的真菌和细菌培养均呈阴性，具体见表2。

表2 阴性对照组微生物培养的结果

“-”表示无菌生长

2.3 阳性对照组微生物培养的结果

阳性对照组的真菌和细菌培养均呈阳性，大肠埃希菌在同样的冲洗条件下生长最慢，经过每膜6次冲洗，所有微生物菌在72 h时成长良好，满足药典要求（表3）。

3 讨论

本研究显示，阴性对照组的真菌和细菌培养均呈阴性，提示本实验有效；阳性对照组微生物培养均呈阳性，提示采用的操作方法不影响抗生素样品中微生物的检出，符合药典规定；在代表性的4种细菌中，大肠埃希菌在同样冲洗条件下生长最慢，提示大肠埃希菌对美罗培南最敏感；经过每膜6次的冲洗，所有微生物均可在72 h时成长良好，满足药典要求，但是冲洗5次则达不到此要求。

2010版《中华人民共和国药典》规定[5]，应根据供试品的特性选择阳性对照菌。本研究验证实验显示，验证用的美罗培南当冲洗量为每膜600 ml时，可消除其抑菌性，且大肠埃希菌对其更为敏感。

综上所述，美罗培南采用薄膜过滤法，总冲洗量为1800 ml，采取人工振荡，可以用大肠埃希菌作为阳性对照菌进行无菌检测。

[参考文献]

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[2] 张伶俐，吉冬梅，金卉怡.碳青霉烯类抗生素的药理学特点及临床应用[J].中国临床研究，2010，23（4）：335-336.

[3] 袁桂清，唐迎曙.新一代碳青霉烯类抗生素美罗培南[J].中华医学杂志，2003，83（1）：65.

[4] 杨新云，吴玉新，洪诤，等.美罗培南等18种β-内酰胺类抗生素对产酶株的抗菌作用[J].现代临床医学生物工程学杂志，2003，9（6）：491-493，498.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2版.北京：中国医药科技出版社，2010：103-105.

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[8] 马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京：北京科学技术出版社，2000：351-354.

（收稿日期：2013-06-27 本文编辑：李亚聪）