纤维素酶活性检测方法简析

摘要：随着生物化学、分子生物学技术以及基因工程等多门交叉学科的快速发展，如何进一步阐明纤维素酶的结构与功能，明确纤维素酶的基因表达与调控的关系，并由此拓展更多更好的研究方法、手段，在纤维素酶的研究方面将具有重要意义。

关键词：纤维素酶；生物传感器；活性

中图分类号：Q539+.3 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-07-0156-1

纤维素是地球上最丰富且可再生的生物聚合物，纤维物质由于结构复杂任何单一的酶都难以将其高效水解。纤维素酶活力测定方法很多，其主要原因在于纤维素酶作用的底物比较复杂，反应产物不同。近年来随着多种交叉学科的快速发展，生物化学、分子生物学以及基因工程等相关领域的研究，促进了更多更新的纤维素酶活测定以及动力学研究方法的出现。

1 纤维素酶系的分类组成

通常，由作用方式不同但能相互协同催化水解纤维素的三类酶，组成一个完整的纤维素酶系：内切葡萄糖苷酶，这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区；外切葡萄糖苷酶，又称纤维二糖水解酶，这类酶作用于纤维素线状分子末端；β-葡萄糖苷酶，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。纤维素酶属于糖苷水解酶，随着各种催化残基鉴定方法出现，以及糖苷水解酶的氨基酸序列和3D结构研究的不断增多，在氨基酸序列相似性基础上确立的新的糖苷水解酶分类方法将糖苷水解酶分为111个族，纤维素酶占其中的16个族。

2 纤维素酶活性的检测方法

纤维素酶各组分的底物专一性不同，而且纤维素酶是多组分复合物。纤维素酶作用的底物也比较复杂，同时不同来源的纤维素酶其组成及各组分的比例有较大的差异，致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。

2.1 传统检测方法

曾报道过传统纤维素酶测定方法很多，如微晶纤维素酶活测定方法、滤纸酶活（FPA）测定方法、水杨苷酶活测定方法、、染色纤维素法、滤纸崩溃法、棉线切断法、羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活性测定方法、棉花糖法、CMC粘度降低法、荧光定糖法平板法。

纤维素酶系总的糖化能力的测定常见有3种：一是通过测定荧光物质的荧光强度的大小，来计算其还原糖含量的荧光法，其主要是根据还原糖与反应液生成荧光物质。二是滤纸酶活（FPA）测定法，纤维素酶系总的糖化能力，通过以滤纸为底物经纤维素酶水解后生成的还原糖的量表征，因为滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料。三是滤纸崩溃法，以滤纸完全崩溃为粉末状所需的时间来表征纤维素酶的活力，在容器内加入缓冲液和适当稀释的酶液，放入一定尺寸的滤纸条，一定温度条件下反复振荡。

外切葡萄糖苷酶活力的测定有棉花糖化法方法和微晶纤维素酶活测定方法两种。两者均采用DNS显色法，通过计算还原糖的量来表征外切葡萄糖苷酶活力，主要是利用纤维素酶降解微晶纤维素、棉。

纤维素酶中内切葡萄糖苷酶对CMC-Na有降解能力，因此内切葡萄糖苷酶活力的表征主要为CMC-Na酶活性测定方法。用标准葡萄糖溶液作标准曲线，通过DNS法显色，针对内切葡萄糖苷酶与CMC-Na降解生成的葡萄糖等还原糖，以每分钟生成相当于1μmol的葡萄糖所需酶量定义为一个酶活性单位，使用分光光度计测其吸光度。

Β-葡萄糖苷酶活性的测定常用方法有3种：一是将它们衍生为无荧光的底物，因为伞形酮（7-羟基香豆素）与4-甲基伞形酮具有强烈荧光的特点，使用荧光法进行测定；二是Barush和Swiain法，它以水杨苷作底物，使释放出来的水杨醇显色（或DNS显色），酶解产物用4-氨基安替比林作显色剂，再用分光光度法比色测定；三是以对-硝基苯-β-葡萄糖苷为底物进行酶解，底物水解后释放出的配基对硝基苯酚可直接在400～420nm波长范围内测定。

2.2 传感器检测方法

与新型先进技术相比，传统方法进行还原糖以及多糖水解酶的酶活测定，还是存在一定缺点，虽然其操作相对简便、快捷。如实验步骤复杂，灵敏度低，有颜色底液严重干扰，重现性差。而生物传感器适应于复杂体系的实时及在线测定，具有快速测定、简便易携、高灵敏度、高专一性，而且检测样品一般可反复多次使用、不需另加其他试剂、不需要预处理、不要求样品清晰度等优点，在监测与控制中显示出巨大的优势。

压电生物传感器（piezoelectric biosensors）通过监测谐振器吸附待测物后频率的变化来检测待测物，主要是利用压电石英谐振器对质量的敏感性，是近二十年来发展起来的一种新型生物传感器。这类传感器最大的优点是不需要任何标记，具有响应灵敏、选择性好、仪器简单、操作方便、便于自动化等优点，成为生物传感器领域的研究热点之一，因此引起了人们的浓厚兴趣。

电化学酶传感器主要由固定化酶膜和电极组成。固定化酶膜可以催化被“识别”出的物质发生化学反应，进行选择性地“识别”被检测的物质，电极则通过仪表显示出来这一催化反应中底物或产物的变量转换成的电信号。

3 小结

不同来源纤维素酶，其组成及各组分的比例有较大的差异。仅运用传统方法对其研究已是远远不够的。而传感器灵敏度高、选择性好、操作简单，正逐步趋向微型化、阵列化，其作为近年发展起来的可对所分析物质进行快速、准确、实时检测的新方法，越来越广泛地应用在研究监测领域中。在已有的相关工作基础上，为今后研制出生产实践过程中纤维素酶酶活在线快速测定方法提供了一定意义和指导作用。

参考文献

[1] 刘佳.袁兴中.曾光明,等.表面活性剂对绿色木霉产纤维素酶影响的实验研究[J].中国生物工程杂志,2006.

[2] 干宁.徐伟民.李天华.纤维素酶活性测定的生物传感器研究[J].纤维素科学与技术,2007.

[3] 黄爱华,李君文,谌志强,等.基因芯片技术检测鉴定临床常见致病真菌初步研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,2007.