通心络对糖尿病心肌病大鼠血流动力学及心肌细胞凋亡的影响

【摘要】目的:探讨通心络对糖尿病心肌病大鼠血流动力学及心肌细胞凋亡的影响,为临床用药提供实验依据。方法:取SD大鼠随机分为3组:正常对照组,糖尿病心肌病变组(Diabetic Myocardi-opathy,DCM组)和通心络干预组(TXL组)。第12周末测定大鼠心室内压及分析心功能。采用Tunel法检测光镜下观察心肌细胞凋亡指数,免疫组化法测定Bcl-2,Bax及P53基因蛋白表达。结果:TXL组治疗组左室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)明显高于DCM组,通心络减少P53、Bax的表达,增加Bcl-2表达,抑制细胞凋亡指数。结论:通心络可以改善糖尿病心肌病大鼠左心室功能,同时通过多种途径有效减少糖尿病大鼠心肌细胞凋亡。

【关键词】通心络;糖尿病心肌病;心功能;细胞凋亡

【中图分类号】R285.5 【文献标识码】B 【文章编号】1008-6455(2010)08-0165-02

糖尿病心肌病(DCM)是指糖尿病患者心肌细胞原发性损伤引起广泛的结构异常,最终引起左心室肥厚、舒张期和(或)收缩期功能障碍的一种疾病状态[1],由Rubler于1972年最早提出。本实验观察了通心络对糖尿病心肌病大鼠左心室功能及心肌细胞凋亡的影响,为该药在糖尿病心肌病的临床应用中提供依据。

1 对象和方法

1.1 对象:2月龄健康雄性SD大鼠(180-200g)42只由(辽宁医学院实验动物中心提供);链脲佐菌素(STZ)购自(美国Sigma公司);通心络(河北以岭药业提供);MedLab生物信号采集处理系统(南京美易公司);TUNEL试剂盒购自(北京博奥森生物技术有限公司);P53、Bax、Bcl-2兔抗小鼠单克隆抗体购自(北京中杉金桥生物有限公司)。

1.2 模型与分组:健康雄性SD大鼠42只,随机分出8只作为正常对照组,其余以45mg・Kg-1一次性尾静脉注射1%STZ溶液,正常对照组注入等量容积上述缓冲液。注射后72h采尾静脉血测血糖,血糖浓度大于16.7mmol・l-1者为糖尿病大鼠模型。

糖尿病模型形成后,普通饲料喂食6周,随机抽取大鼠10只,取心肌组织观察微细结构,糖尿病心肌病变模型形成标准为 :心肌肌原纤维排列紊乱,局部断裂明显,肌丝成分减少,间质胶原纤维增生;心肌内微血管内皮细胞明显肿胀,核染色质边集,基底膜出现不规则明显增厚,微血管瘤形成;线粒体肿胀变形、嵴稀疏,排列紊乱,结构不清。余24只糖尿病大鼠随机分为两组:糖尿病心肌病变对照组(DCM组)和通心络干预组(TXL组)。

糖尿病大鼠心肌病变模型制备成功后,TXL组(12只)用通心络超微粉(1.43g生药/g干粉)0.5g・kg-1・d-1,每天灌胃一次;正常对照组(8只)和DCM组(12只)等容量纯净水每天灌胃一次。连续6周。

1.3 指标测定:心室内压的测定:第12周末,各组大鼠用质量分数为20%的乌拉坦溶液5 ml・Kg-1腹腔注射麻醉,仰卧固定,颈正中切口,气管插管;手术游离右颈总动脉,动物肝素化后,经右颈总动脉向左心室插入自制的心室插管(d=1.5 mm,充满质量分数为1%的肝素溶液),稳定20 min后,用MedLab生物信号采集处理系统记录左心收缩压(LVSP)和左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

心肌细胞凋亡测定:大鼠心肌常规石蜡切片后,心肌细胞凋亡按末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞核的3,末端每只大鼠随机取4张切片观察,每张切片计数5个高倍视野(400×)中的凋亡阳性细胞核数/总细胞核数,取其平均值为细胞凋亡指数。Bcl-2,Bax及P53基因蛋白表达按试剂盒说明书免疫组织化学染色法检测。每只大鼠随机取5张切片观察,每张切片计数5个高倍视野(400×),计算其平均灰度值。

1.4 统计分析:计量资料用(x±s)表示,组间差异比较用方差分析,两组间比较用LSD法。

2 结果

2.1 大鼠的一般情况:大鼠尾静脉注射STZ72小时,血糖均大于16.7mmol・l-1,大鼠糖尿病模型制备成功。6周后随机抽取大鼠观察微细结构证实大鼠糖尿病心肌病变模型制备成功。DCM组因感染或糖尿病加重死亡4只,余8只进入实验;TXL组麻醉过重死亡2只,用药过程中死亡2只,可能由于灌胃操作不当或者通心络含蜈蚣,全蝎等有毒成分所致,余8只进入实验;正常对照组无大鼠死亡。

2.2 血流动力学变化:与正常对照组相比,TXL组和DCM组LVSP、±dp/dtmax显著下降(均p

2.3 Bcl-2、Bax与P53基因蛋白表达:与正常组相比,TXL组和DCM组Bcl-2基因蛋白表达的灰度值显著升高(均p

DCM最终引起左心室肥厚、舒张期和(或)收缩期心功能的改变,而心功能是研究心血管药理的基本方法。葛敏[2]刘彤发现糖尿病大鼠12周末时心脏的收缩功能和舒张功能均发生障碍,表现为LVSP显著降低,LVEDP显著升高,±dp/dtmax显著降低,这与我们的观察一致。本实验中应用通心络后,该组大鼠LVSP显著升高,LVEDP显著降低,±dp/dtmax升高,且-dp/dtmax升高比+dp/dtmax升高明显,提示通心络能够改善DCM大鼠心脏舒缩功能障碍,尤其是舒张功能。

细胞凋亡是在自身调控基因作用下,启动自身内部机制,通过激活内源性 DNA内切酶而进行的一种主动死亡过程,在维持多细胞生物的生长发育体内平衡及免疫防御中起着重要作用[3]与凋亡相关的蛋白很多,其中P53、Bax以及 Bcl-2蛋白是目前公认的影响细胞凋亡的重要因素。Bcl-2是一种抑制凋亡的线粒体内膜蛋白,主要功能是促进细胞生存,延长细胞寿命,抑制细胞凋亡; Bax为Bcl-2家族中的一员,与 Bcl-2不同,Bax是细胞凋亡的促进因子,能促进细胞凋亡的发生。Kirshenbaum 等研究心肌细胞凋亡的分子调节机制,结果证实 p53 基因为心肌细胞凋亡的激活因子,并且指导促凋亡基因Bax 的转录,而且由 p53 激活的心肌细胞凋亡可以被抗凋亡基因Bcl-2 所阻断,支持了Bcl-2 是一个强有力的抗凋亡因子[4]。刘欣[5],吴建宇[6]研究显示,糖尿病(DM)时,P53、Bax表达增加,Bcl-2表达减少与本实验结果一致。

本实验结果显示DCM组大鼠心肌凋亡细胞数目明显升高,与Backlund报道一致[7]。在糖尿病及其并发症的发生和发展过程中,细胞凋亡起着重要作用,研究证实使用不同血糖浓度培养心肌细胞发现,细胞凋亡程度与血糖浓度成正相关,高血糖通过活性氧簇线粒体途径导致心肌细胞凋亡[8]。高糖激活了P53基因并使P53蛋白糖基化.引起血管紧张素Ⅱ合成增加。血管紧张素Ⅱ再通过P38有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)使P53蛋白磷酸化,最终引起心肌细胞凋亡[9]同时氧自由基亦可直接引起P53表达增加,抑制Bcl-2的表达,增强Bax的表达。应用通心络后,该组大鼠心肌细胞中P53、Bax表达减弱、Bcl-2表达增强,与DCM组比较差异有显著性,提示通心络可以通过调节P53、Bax、Bcl-2表达抑制心脏中细胞凋亡。同时TXL组心肌凋亡细胞数目显著减少,考虑通心络可以通过阻断上述途径抑制糖尿病大鼠心肌细胞凋亡。

中医认为,DCM基本病理变化是微血管病变,属于络病范畴[10]。络病提倡“络以通为用”的治疗原则。而通心络由水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、人参、赤芍、冰片等组成的中成药,具有益气活血、通络止痛之功效,本实验结果表明通心络能抑制DCM心肌细胞凋亡进而改善心功能。

参考文献

[1] 葛敏,刘彤等.绞股蓝总苷对糖尿病心肌病大鼠心脏功能的影响.沈阳药科大学学报,2007,24(60):355-359

[2] 纪征,许丽辉,张燕等.糖尿病大鼠心肌细胞中survivin-p27mRNA表达及相关蛋白变化的研究,中国老年学杂志[J],2009,1(29):167-168

[3] 刘欣,赵秀兰等.糖尿病大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达研究.中国心血管杂志,2005,10(1):4-7

[4] 吴建宇,唐风华等.灵芝孢子粉对糖尿病大鼠心肌细胞Bax、Bcl-2基因表达影响.海峡医药,2007,19(9):19-21

[5] 程国杰,崔亮.糖尿病心肌病与心肌细胞凋亡.北京医学[J].2008.30(1):46-47

[6] 吴以岭,“脉络-血管系统病”新概念及其治疗探讨.疑难病杂志[J].2005,4(5):285-287