枸杞子对D-半乳糖致免疫衰老小鼠胸腺功能的作用

[摘要] 目的：建立D-半乳糖致衰老动物模型，并设置不同处理，研究枸杞子对于小鼠胸腺功能的作用，确定其对于免疫衰老的影响。方法：小鼠分组进行造模并给药；实时定量PCR方法对处理后小鼠胸腺初始T细胞标记物（sjTRECs）进行绝对定量以评价免疫中枢器官胸腺的生成和输出功能。结果：小鼠胸腺和脾脏的T淋巴细胞中的sjTRECs的含量：d-Gal模型组

[关键词] 免疫衰老；D-半乳糖；胸腺

[中图分类号] R392[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）07（c）-013-02

Fructus Lycii influence investigation to thymus function in D-galactose induced immunosenescence mouse model

ZHANG Hua-hua, LIANG Peng

（Department of Biology, Guangdong Medical College，Dongguan 523808,China）

[Abstract] Objective: To establish and evaluate D-galactose induced immunosenescence mouse model; to investigate Fructus Lycii function to mouse thymus in D-galactose induced immunosenescence.Methods:Establish different treated groups. The new marker of naive T cell（sjTRECs）levels in murine thymocytes and splenocytes were detected by real-time PCR method to reflecting the amount of naive T cell and thymus function. Results: sjTRECs levels in murine thymocytes and splenocytes: D-Gal group < Fructus Lycii group < control group（P

[Key words] Immunosenescence; D-Galactose; Thymus

胸腺作为哺乳动物重要的中枢免疫器官，它的功能和状态直接影响机体的免疫功能，胸腺的退化是机体免疫衰老的直接原因[1]。D-半乳糖（D-Gal）致动物衰老模型目前已得到了广泛的应用和极其大量的文献报道[2]。已有研究认为，D-半乳糖可能造成免疫器官萎缩从而导致免疫衰老 [3]。笔者的前期研究也证实D-半乳糖处理动物后，其胸腺发生退化，胸腺的T细胞生成和输出功能降低，最终导致免疫衰老。

枸杞子为茄科植物枸杞的干燥成熟果实，是常用的滋补性中药，具有多种药理和保健作用，久服有延年益寿，延缓衰老之效果。本研究利用实时定量PCR方法对胸腺初始T细胞标记物（sjTRECs）进行绝对定量以评价胸腺的T淋巴细胞生成和输出功能，研究枸杞子对于D-半乳糖致衰老小鼠的胸腺功能的影响，从而确定枸杞子对于机体胸腺相关的免疫衰老的作用，为阐明其延缓衰老作用机制提供进一步的实验研究。

1材料与方法

1.1实验动物和试剂

4~5周清洁级BALB/c小鼠30只，购自广东实验动物中心，雌雄兼用。D-Gal：Amresco；枸杞：枸杞子购于广州中医药大学门诊部，并经我校药学院鉴定。DNAzol：DNA抽提试剂 ，Invitrogen公司； SYBR Premix Ex Taq TM：实时定量PCR试剂，Takara 公司；ABI Prism 7000 sequence detector：实时荧光定量PCR仪，ABI 公司。实时定量PCR测定的sjTRECs上下游引物分别为：5' CATTGCCTTTGAACCAAGCTG 3'，5' TTATGCACAGGGTGCAGGTG 3'；标准曲线的引物为：5' TGACGTGGTGTATAGTCGA 3'，5' TCCTGAAGTTCTGGGAGA 3'。

1.2实验方法

1.2.1枸杞子水煎剂的制备取枸杞子100 g用水煮沸 2次，每次30 min，过滤，将2次的滤液混合浓缩至100 ml，即为100%枸杞子水煎剂，其浓度相当于生药量1 g/ml。

1.2.2造模与给药BALB/c小鼠随机分为3组，即对照组D-Gal衰老模型组和枸杞组，每组10只。D-Gal衰老模型组和枸杞组每天颈背部皮下注射剂量为500 mg/kg的D-半乳糖溶液, 对照组注射等量的生理盐水,每天1次,连续注射8周,枸杞组在注射D-半乳糖的同时，每天用 100%枸杞子水煎剂0.4 ml（0.2 ml/10 g） 灌胃。对照组和衰老模型组每天生理盐水灌胃0.4 ml。连续造模和给药8周。自由进食进水，常规管理。

1.2.3 实时定量PCR检测细胞中sjTRECs含量笔者等建立了实时定量PCR检测细胞中sjTRECs含量以评价胸腺的生成和输出功能的方法[4]，步骤简述如下：获取胸腺和脾脏细胞；提取小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞基因组DNA；进行实时定量PCR反应，建立标准曲线，反应条件为：

在同一次反应中，设置标准质粒(103～108拷贝)反应组，标准质粒阴性对照组，样品RAG2片段 PCR组，RAG2阳性对照组，样品TREC片段PCR组，TREC阳性对照组，阴性对照组，各组都设2个平行重复；根据标准曲线和样本PCR反应Ct值得出样本中TREC和RAG2的拷贝数，由[（TREC拷贝数1+TREC拷贝数2）/（RAG2拷贝数1+ RAG2拷贝数2）]×2 000 000公式可以得到1 000 000个细胞中的TREC拷贝数。

2结果

本实验以梯度稀释标准质粒的Ct值为纵坐标，标准质粒浓度自然对数为横坐标，可以得到一条严格的直线型标准曲线，并获得一元回归方程：Y=-3.767X+38.931，斜率为 -3.767, R2＝0.996（图1），证实了该方法定量的准确性。这条曲线由实时定量PCR仪器的分析软件自动生成。复孔的重复性好,证明加样的误差小。

图1 标准曲线

Fig 1 Standard curve

经公式计算可以获得不同处理组的胸腺和脾脏的T淋巴细胞中的sjTRECs的含量。我们发现，和对照组相比，D-Gal衰老模型组的胸腺和脾脏的T淋巴细胞中的sjTRECs的含量明显降低，差异有显著性（图2）。表明D-Gal衰老模型组的胸腺和脾脏内初始T细胞的含量均显著降低。枸杞组的小鼠胸腺和脾脏的T淋巴细胞中的sjTRECs的含量均低于对照组，但差异无显著性；但高于D-Gal组，差异有显著性。

3讨论

胸腺是哺乳动物重要的中枢免疫器官，它是T细胞发育、分化、成熟、输出的场所，具有初始T细胞的生成和输出的重要免疫功能。利用实时定量PCR方法可以准确的评价胸腺功能和状态。信号结合T细胞受体重排删除环（signal joint T cell receptor rearrangement excision circles, sjTRECs） 是在TCRα基因重组过程中形成的环状的DNA，其含量可以代表功能性TCR形成时初始T细胞的数量。对sjTRECs进行定量分析已发展成为公认的胸腺功能检测指标，广泛应用于临床和基础研究中[5]。

在本研究中，D-Gal衰老模型组与对照组相比，小鼠胸腺和脾脏的初始T细胞的数量显著减少，表明胸腺的生成和输出功能显著减弱，是胸腺退化的一个主要方面。表明在个体水平上，D-Gal作用于胸腺器官，降低了胸腺的生成和输出功能，破坏了胸腺微环境，发生明显的胸腺退化，最终导致免疫衰老。本研究成功建立的D-半乳糖致免疫衰老的动物模型，可为以后的抗衰老的研究提供实验基础。

本研究的结果表明，枸杞组的小鼠胸腺和脾脏初始T细胞数目较D-Gal组显著增加，表明胸腺的生成和输出功能并没有发生破坏性的降低，而是维持在和对照组相似的水平上，证实枸杞子可以保护胸腺器官的功能性，延缓胸腺相关的免疫衰老，即从分子和细胞水平上证实了枸杞子具有延缓衰老和免疫保护的作用。

[参考文献]

[1]Chidgey AP, Boyd RL. Stemming the tide of thymic aging[J].Nat Immunol. 2006,7(10):1013-1016.

[2]詹向红，杨靖，赵君玫.益气健脾方药对D-半乳糖拟衰小鼠自由基代谢及免疫功能的影响[J].中国老年学杂志，2005,25(8):934－933.

[3]Wei Hai-feng, Li Lin, Song Qiu-jie, et al. Behavioural study of the d-galactose induced aging model in C57BL/6J mice[J]. Behavioural Brain Research，2005, 157(2): 245-251.

[4]张华华,曾耀英.实时定量PCR检测小鼠成熟过程中淋巴细胞SJTERC水平[J].第四军医大学学报，2005，26(15) :1370-1373.

[5]耿素霞，李扬秋.胸腺功能及其测定方法的研究进展[J].免疫学杂志，2005,21：427-430.

（收稿日期：2008-06-24）

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