防治哮喘用白芥子涂法复方巴布剂的制备及体内外研究

[摘要] 该研究优化了白芥子涂法巴布剂处方和工艺，在体动物模型上评价其预防哮喘效果。首先以人体感官评价作为指标，对涂布厚度、交联剂类型、甘羟铝用量、聚丙烯酸钠用量、黏合剂类型进行了单因素考察。以初黏力、剥离强度、人体感官评价作为指标，以甘油、柠檬酸、羧甲基纤维素钠作为主要影响因素进行了巴布剂空白基质的正交试验优化。空白巴布剂最优处方质量比为：甘油-水-乙醇-PEG400-甘羟铝-柠檬酸-羧甲基纤维素钠-聚丙烯酸钠2∶8∶0.8∶0.4∶0.07∶0.15∶0.1∶0.5。采用醇提法提取白芥子、延胡索、甘遂有效成分，挥发油提取器提取细辛挥发油。通过初黏力、剥离强度、人体感官评价，每100 g巴布剂中最佳含药量为11 g（11%）。建立哮喘模型大鼠，以挠鼻时间作为指标，证明高剂量组（17%）白芥子涂法巴布剂对哮喘模型大鼠的挠鼻时间有显著抑制作用（P=0.037<0.05），中剂量（11%）、低剂量（4%）和市售三伏贴组在给药前后大鼠挠鼻时间无显著性差异。该研究为哮喘预防提供了一种新选择。

[关键词] 巴布剂; 经皮; 哮喘

[收稿日期] 2014-09-16

[通信作者] *金义光，博士，研究员，Tel： （010）66931220，E-mail：

[作者简介] 杜丽娜，博士，副研究员，研究方向为经皮肤/黏膜给药系统、纳米靶向制剂，Tel： （010）66930216， E-mail：

哮喘是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症，在易感者中此种炎症可引起反复发作的喘息、气促、胸闷和咳嗽等症状，多在夜间和凌晨发生，气道对多种刺激因子反应性增高。近年来，世界上许多国家的哮喘病率和死亡率有上升趋势，我国哮喘的患病率约为1%，儿童可达3%，全世界约有1亿哮喘病患者，已经成为严重威胁公众健康的一种主要慢性疾病。尤其近年在国内经常出现持续的大面积雾霾天气，使呼吸道疾病患病率逐渐上升，有效治疗哮喘、提高生活质量刻不容缓。

外敷法治疗哮喘的药物多以清代名医张璐的《张氏医通》所记载的“白芥子涂法”为基础制成。“白芥子涂法”中的药物主要为白芥子、延胡索、甘遂、细辛、生姜等，将这些药物捣碎后，用生姜汁调成糊状，贴于人体的肺俞等穴位处，利用人体在三伏天阳气旺盛，气血浮于表，皮肤松弛，毛孔张开等特点，加快药物透皮吸收从而达到较好的治疗效果[1]。其中白芥子可利气豁痰，温中散寒，通络止痛;延胡索可活血、利气、镇痛、镇静;甘遂有泻水逐饮、消肿散结的作用;细辛可祛风散寒，治疗痰饮咳逆、风湿痹痛;生姜可散寒发汗，化痰止咳，和胃止呕。本方一方面可刺激穴位，疏通经络，调理气血，协调阴阳抗御病邪;另一方面，特定药物在特定穴位被吸收，能充分发挥药理作用。巴布剂 （cataplasm）系指将药材提取物、药材或化学药物与适宜的亲水性基质混合均匀后，涂布于背衬材料上制成的贴膏剂。巴布剂具有给药剂量准确、血药浓度稳定、药量可控并缓释、载药量大、透皮效果好、无刺激、患者顺应性好等优点;同时，不含传统膏药所特有的黄丹、香油等物质，不会产生铅中毒、皮肤过敏等不良反应[2]。上海雷允上药业的“复方紫荆消伤膏”是国内第一个获得新药证书的巴布剂产品。

本研究采用现代制剂工艺与传统的外敷法治哮喘处方相结合，制备平喘巴布剂，系统研究了有效成分提取、巴布剂基质筛选、中药复方巴布剂制备及性质考察、药效学评价，为哮喘防治提供一种新型中药复方巴布剂。用现代新型制剂技术模拟三伏贴防治哮喘是中药现代化的具体体现。

1 材料

甘油（西陇化工股份有限公司，批号124152）;聚乙二醇400（南京威尔化工有限公司，批号20120524）;无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号20131114）;甘羟铝 （陕西太白山制药有限责任公司，批号20130302）;柠檬酸（国药集团化学试剂有限公司，批号T20100913）;羧甲基纤维素钠（中国医药上海化学试剂有限公司，批号F20030626）;聚丙烯酸钠（国际特品，批号231770A）;白芥子、延胡索、甘遂、细辛均购自安徽省亳州市中药材市场;氮酮（北京化学试剂公司，批号010619）;无纺布（浙江弘扬无纺新材料有限公司）;隔离膜（佛山兰迪胶粘材料厂）;蒸馏水，生姜油（由本所天然药物化学课题组提供）;SD大鼠（军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号SCXK-（军），雌雄各半，140～160 g）。

电热套（黄骅市新兴电器厂，型号ZDHW）;电动测试仪（上海锴凯科技贸易有限公司，型号DG-2000A）;小型实验用涂布机（上海锴凯科技贸易有限公司，型号TB-0612B）;电热鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司，型号DZF-150）;冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司，型号FD-1-55）;电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司，型号JM-B2002）;电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司，型号BS110S）。

2 方法与结果

2.1 空白基质筛选

2.1.1 制备方法 空白基质各组分初始质量比为：甘油-水-乙醇-聚乙二醇400（PEG400）-氢氧化铝-柠檬酸-羧甲基纤维素钠-聚丙烯酸钠-聚维酮2∶8∶0.8∶0.4∶0.15∶0.15∶0.15∶0.5∶0.015。

称取处方量甘油、乙醇、PEG400加入同一烧杯中，低速搅拌下分别加入处方量聚丙烯酸钠、聚维酮K30和羧甲基纤维素钠，搅拌均匀后作为A相;称取处方量氢氧化铝和柠檬酸，加入一定量水中，搅拌均匀后作为B相，搅拌条件下将A相和B相混合均匀即得空白基质[3]。

将配制好的空白基质倒入试验用小型涂布机中制备巴布剂，放入40 ℃恒温干燥箱中熟化1 h，取出后室温放置成型，即得空白巴布剂成品。

2.1.2 评价指标 初黏力：初黏力是指物品的表面黏着力。测定方法为：将巴布剂剪成合适大小，除去隔离层后贴于电动测试仪（图1A）上方的台面上，在巴布剂上放置一个100 g砝码，将传感器感应头朝上，调整上限位，使测头刚好将砝码顶起（不可顶翻），停留5 s后，感应头自动向下移动，到达下限位后，停止移动，按下传感器的“PEAK”键，可得到传感器向下运动的极值，此极值作为初黏力值（单位N），重复3次，求平均值。

图1 多功能胶强度测定仪（A）及自制剥离强度测定装置（B）

Fig.1 The instrument picture of the multifunctional gel strength determinator （A） and peeling strength determinator designed by ourselves （B）

剥离强度：剥离强度是指物体对另一个表面的附着力。测定方法为：将巴布剂剪成4 cm×10 cm大小，揭除隔离膜后，室温平衡2 h，将其黏于洁净的不锈钢板上，用2 kg辊筒来回滚压3次，放置20 min。将不锈钢板竖直放置（图1B），将巴布剂上方剥离呈180°翻转后接一220 g重物，记录巴布剂从钢板剥离的时间（单位s）。重复3次，求平均值[4]。

人体感官评价：随机选取6人，于手腕内侧贴敷相同面积巴布剂（2 cm×2 cm），按所述指标进行人体感官评价（表1）。

表1 人体感官评价表

Table 1 Evaluation index of human sensing

考察指标具体要求满分分数

外观性状色泽均匀，无明显颗粒、气泡5

舒适性软硬舒适，无刺激及紧绷感5

皮肤追随性粘于手腕，用力甩10次不掉5

膏体残留性揭除后，是否残留，膏面是否破坏5

反复黏贴性反复粘贴仍保持良好黏性5

2.2 空白基质处方单因素考察

2.2.1 涂布厚度选择 由于巴布剂涂布厚度直接决定了其含膏量（一般不少于0.1 g・cm-2），因此通过测定巴布剂含膏量的方法，确定巴布剂涂布厚度。

按已有处方制备不同涂布厚度的空白巴布剂，参考2010年版《中国药典》一部附录Ⅱ中含膏量测定第二法测定。将不同厚度巴布剂各取1片，除去盖衬，精密称定，置烧杯中，加水适量，加热煮沸至背衬与膏体分离后，取出背衬，用水洗涤至背衬无残留膏体，挥去溶剂，在105 ℃烘干箱中30 min，然后移至干燥器中，冷却30 min，精密称定，减失质量即为膏重，按标示面积换算成100 cm2的含膏量（表2）。

表2 不同涂布厚度对应的含膏量

Table 2 The correlation between spreading thickness and cataplasm contents

涂布厚度/mm含膏量/g

27.899 4

2.39.105 3

2.59.736 1

2.811.443 8

313.431 4

当涂布厚度为2.80，3.00 mm时，其含膏量均大于0.1 g・cm-2。考虑到巴布剂载药量，将涂布厚度暂定为3.00 mm。

2.2.2 交联剂筛选 固定其他条件，选择氢氧化铝、甘羟铝、氯化铝作为交联剂，制备空白巴布剂基质，评价其外观。以氢氧化铝为交联剂，基质黏性小，流动性大，气泡较少;以甘羟铝为交联剂，基质黏性大，流动性较小，气泡少;以氯化铝为交联剂，基质分层，无黏性。因此确定甘羟铝为交联剂。

2.2.3 甘羟铝用量的考察 固定其他条件，根据基质涂布时延展性和人体感官评价结果，优化甘羟铝最佳用量。称取甘油10 g，水40 g，乙醇4 g，PEG400 2 g，聚丙烯酸钠5 g，柠檬酸0.75 g，PVP K30 0.075 g，CMC-Na 0.75 g，甘羟铝用量分别为0.25，0.35，0.50，0.75 g，按2.1.1项下方法制备成基质。甘羟铝用量为0.50，0.75 g时，无法均匀涂布;当甘羟铝用量为0.25，0.35 g时，可均匀涂布于无纺布上，进一步进行其人体感官学评价。最终确定甘羟铝用量为0.35 g（表3）。

表3 不同用量甘羟铝制备巴布剂的人体感官评价

Table 3 Human sensing evaluation of the cataplasm with dihydroxyaluminum aminoacetate of different doses

甘羟铝用量/g外观性状舒适性皮肤追随性膏体残留性反复黏贴性总分

0.254344318

0.355344420

2.2.4 聚丙烯酸钠用量考察 固定其他条件，根据人体感官评价结果，优化聚丙烯酸钠最佳用量。最终确定聚丙烯酸钠用量为5 g（表4）。

2.2.5 黏合剂筛选 固定其他条件，以人体感官评

表4 不同用量聚丙烯酸钠制备巴布剂的人体感官评价

Table 4 Human sensing evaluation of the cataplasm with sodium polyacrylate of different doses

聚丙烯酸钠用量/g外观性状舒适性皮肤追随性膏体残留性反复黏贴性总分

32344417

53344418

74334216

价作为指标，筛选最佳黏合剂：PVP-K30，明胶和CMC-Na（表5）。最终确定CMC-Na作为黏合剂。

表5 含不同黏合剂巴布剂的人体感官评价

Table 5 Human sensing evaluation of the cataplasm with different adhesives

考察指标外观性状舒适性皮肤追随性膏体残留性反复黏贴性总分

PVP K302342315

明胶4342316

CMC-Na4344318

2.2.6 正交试验优化处方 以甘油（A，用量分别为15，20，25 g）、柠檬酸（B，用量分别为1.0，1.5，2.0 g）、CMC-Na（C，用量分别为1.0，1.5，2.0 g）作为影响因素，以初黏力（单位：N）、剥离强度（单位：s）和人体感官评分结果为考察指标，设计L9（34）正交实验优化处方（表6）。

表6 正交实验优化结果

Table 6 Optimized results of the orthogonal design

处方A

甘油

/gB

柠檬酸

/gC

CMC-Na

/g初黏力

/N剥离强度

/t・s-1人体感官

评分

11111.078±0.00115.1±3.3716

21221.148±0.00614.4±2.6916

31331.160±0.05110.7±2.5416

42131.262±0.03615.1±2.4617

52211.267±0.02937.3±9.3320

62321.229±0.00516.3±1.7320

73121.215±0.01316.8±2.6820

83231.214±0.02612.4±2.0420

93311.592±0.12428.2±1.8817

均值11）1.1291.1851.312

均值21）1.2531.2101.197

均值31）1.3401.3271.212

极差1）0.2110.1420.115

均值12）13.40015.66726.867

均值22）22.90021.36715.833

均值32）19.13318.40012.733

极差2）9.5005.70014.134

注：1）初黏力直观分析，2）剥离强度直观分析。

由初黏力直观分析结果可知，各因素对巴布剂初黏力影响顺序为：甘油>柠檬酸>CMC-Na，最优处方为A3B3C1。

由剥离强度直观分析结果可知，各因素对巴布剂剥离强度的影响顺序为：CMC-Na>甘油>柠檬酸，最优处方为A2B2C1。

随甘油和柠檬酸用量增加，巴布剂初黏力也逐渐增加，因此确定最优处方为A2B2C1，即甘油用量为20 g，柠檬酸用量为1.5 g，CMC-Na用量为1.0 g。

最终确定最优空白巴布剂基础处方质量比为：甘油-水-乙醇-PEG400-甘羟铝-柠檬酸-羧甲基纤维素钠-聚丙烯酸钠 2∶8∶0.8∶0.4∶0.07∶0.15∶0.1∶0.5。

2.3 中药有效成分的提取

2.3.1 白芥子、延胡索、甘遂有效成分提取 将处方量白芥子-延胡索-甘遂（2∶2∶1）粉碎成粗粉，装入1 000 mL圆底烧瓶内，置于电热套中，加入8倍量60%乙醇-水溶液，连接回流装置，保持微沸1 h后，倒出提取液，再向圆底烧瓶中加入8倍量60%乙醇水溶液，加热回流1 h，合并2次提取液[5]。

将提取液转入茄型瓶中，70 ℃减压浓缩，将浓缩液分装在100 mL烧杯中（不超过烧杯1/5），于-20 ℃冷冻。冷冻干燥24 h后得到有效成分干粉。

2.3.2 细辛挥发油提取 根据2010年版《中国药典》一部附录XD“挥发油测定法”中的甲法提取：取细辛适量置于1 000 mL圆底烧瓶中，加水适量与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油提取器和回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油提取器的刻度部分，并溢入烧瓶为止。用电热套缓慢加热，保持微沸5 h，直至测定器中油量不再增加，停止加热。放置片刻，打开测定器下端活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达0线上面5 mL处止。放置1 h，开启活塞使油层下降至其上端恰好与0线齐平，读取挥发油量，收集挥发油备用。

2.4 治疗哮喘用中药复方巴布剂含药量考察

称取甘油 40.0 g、无水乙醇 16.0 g、PEG-400 8.0 g于300 mL烧杯中，称取聚丙烯酸钠 10.0 g、CMC-Na 2.0 g、细辛挥发油 0.225 mL、氮酮 2.5 g（为基质总质量的1%）和生姜油适量加入上述烧杯中，搅拌均匀作为A相;称取甘羟铝 1.4 g、柠檬酸 3.0 g、有效成分干粉10 g于200 mL烧杯中，加入蒸馏水 160 mL，搅拌均匀作为B相;将B相缓慢加入A相，沿同一方向缓慢搅拌均匀得到含药巴布剂。同法制备空白巴布剂基质和有效成分干粉量分别为10.0，30.0，50.0 g的载药巴布剂（有效成分质量分数分别为4%，11%，17%），将上述巴布剂基质倒入涂布机储料槽中，涂布于无纺布上，并被覆隔离膜。放置熟化成型，得巴布剂成品。

2.5 含药巴布剂性质测定 依上法制备空白及载药巴布剂，测定其初黏力、剥离强度及人体感官评价指标（表8）。随有效成分干粉量增多，巴布剂总体感官评价不断变优，初黏力和剥离强度也逐渐增大。因此确定治疗哮喘用中药复方巴布剂含药量为：每 100 g巴布剂中含药量为17 g（17%）。

表8 空白及不同载药量巴布剂性质评价

Table 8 Characterization evaluation of blank cataplasm and drug-loading cataplasm of different doses

有效成分量/%人体感官评价/分初黏力/N剥离强度/s

0180.715±0.0021.8±0.4

4180.798±0.0032.8±0.3

11210.845±0.0126.1±0.6

17230.908±0.0057.7±1.5

2.6 药效学评价

取SD大鼠25只，随机分为5组，每组5只：阴性对照组、阳性对照组（三伏贴，北京中西医结合医院院内制剂）、17%含药量组、11%含药量组、4%含药量组中药复方巴布剂。建立哮喘大鼠模型，具体操作如下（图2）。

图2 哮喘大鼠模型的建立及药效学评价方案

Fig.2 Establishment of asthma rats model and pharmacodynamics evaluation

17%含药量组中药复方巴布剂对哮喘模型大鼠的挠鼻时间有显著抑制作用（P=0.037<0.05），11%，4%含药量组和市售三伏贴组在给药前后大鼠挠鼻时间无显著性差异（图3）。

3 讨论

巴布剂中基质选择十分重要，本研究以聚丙烯酸钠作为基质，羧甲基纤维素钠作为黏合剂，甘油和PEG400作为保湿剂，甘羟铝作为交联剂，通过单因素考察和正交设计优选出初黏力和剥离强度适宜，人体感官评价较好的巴布剂处方。美中不足是当有效成分质量分数为17%时，存在膏体脱落现象，下步工作尚需解决该问题。

哮喘发病机制复杂、病理生理机制不明确，许多临床研究无法开展，因此复制接近人类哮喘病理生

图3 白芥子涂法巴布剂对哮喘模型大鼠挠鼻时间的抑制作用

Fig.3 The inhibition effect of cataplasm of white mustard seed varnish on scratching nose time of asthma rats

理状态的哮喘动物模型意义重大。支气管哮喘动物模型包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、犬、兔、羊、猫及灵长类等，常用动物为豚鼠。豚鼠易致敏，接受致敏物质后反应程度比较强，能产生I型变态反应。但豚鼠过敏反应差异较大，其变态反应多由IgG而非IgE介导，与人类不同[6]。小鼠哮喘模型以其免疫、遗传背景清楚得到广泛应用。但也具有较多局限性：①不出现人类哮喘特征性的黏膜炎症及上皮层嗜酸性细胞浸润;②不出现人类哮喘典型的慢性气道炎症和上皮变化;③大多数模型出现过敏性肺泡炎和超敏性肺炎，掩盖了气道的炎症损害;④气道狭小，肺和支气管功能测定技术难度大[7]。大鼠品系纯正、标本采集量大、对抗原反应较一致，能诱发出与人类哮喘相似的迟发相反应[8]。因此本实验选用大鼠作为动物模型。

目前哮喘动物模型主要有过敏性哮喘模型、感染性哮喘模型、转基因动物哮喘模型。过敏性哮喘在临床上较常见，多采用变应原诱发方法制备过敏性哮喘模型，常用变应原有卵清白蛋白、花粉、蛔虫卵、霉菌、尘螨等。本实验采用卵清白蛋白、以氢氧化铝作为免疫佐剂诱发哮喘[9-10]。文献中多以腹式呼吸明显、呼吸频率加快、节律不整、活动减少等症状作为评价指标[10]，主观性较强，本研究采用大鼠挠鼻次数作为量化指标，更为客观。

本研究为哮喘预防提供了一种新选择，下步工作尚需从分子水平，如内皮素、一氧化氮、白介素-5等方面评价该中药复方巴布剂的防治效果。

[参考文献]

[1] Guo X， Lu H， Lin Y， et al. Skin penetration of topically applied white mustard extract and its effects on epidermal Langerhans cells and cytokines[J]. Int J Pharm， 2013， 457： 136.

[2] 刘淑萍. 巴布剂的研究进展及临床应用[J]. 现代预防医学， 2010， 37（16）： 3188.

[3] 张玲， 刘艺萍， 余伟民， 等. 双乌黑蚁巴布剂的制备及稳定性考查[J]. 中成药， 2013， 32（10）： 1804.

[4] 李勇. 水性巴布剂基质配方研究[J]. 中国药师， 2006， 9（10）： 911.

[5] 王晓玲， 许丽， 胡利华， 等. 正交试验法优选白芥子延胡索甘遂合并提取的工艺[J]. 药学学报， 2006， 22（3）： 187.

[6] J Temlcovski， S P Hogan， D P Shepherd. An improved murine model of asthma： selective airway inflammation， epithelial lesions and increased methacholine responsiveness following chronic exposure to aerolized allergen[J]. Thorax， 1998， 53： 849.

[7] 余兵， 何权瀛， 高占成. 糖皮质激素及茶碱对哮喘小鼠气道炎症与肺内一氧化氮抑制作用的研究[J]. 中华结核和呼吸杂志， 1998（11）： 664.

[8] 马俊鹏， 常军民， 卢冬梅. 中药治疗哮喘的基础实验研究进展[J]. 西北药学杂志， 2008， 23（3）： 186.

[9] 王茵萍， 徐月红， 陈宝， 等. “白芥子涂法”复方及单味药抗豚鼠哮喘效应的比较[J]. 江苏医药， 2011， 37（14）： 1643.

[10] 王平平， 王升旭， 王艳杰， 等. 穴位贴敷经皮给药药贴对哮喘豚鼠血清中环氧化酶-2水平的影响[J]. 广州中医药大学学报， 2010， 27（3）： 236.

Preparation， in vitro and in vivo evaluation of cataplasm of

white mustard seed varnish to prevent asthma

DU Li-na1，2， ZHU Wei-nan1，2， LIU Xiao-yan1， CHEN Wen-yang1，2， YU Xiang1，3， LI Miao1， JIN Yi-guang1，2*

（1. Department of Pharmaceutical Sciences， Beijing Institute of Radiation Medicine， Beijing 100850， China;

2. Department of Pharmacy， Bengbu Medical College， Bengbu 233030， China;

3. Anhui Medical University， Hefei 230001， China）

[Abstract] The aim of the manuscript was to optimize formulations and preparation technologies of cataplasm of white mustard seed varnish， and to evaluate its anti-asthma effect on rats. The single factor experiments included spreading thickness， types of crosslinking agents， dihydroxyaluminum aminoacetate amount， sodium polyacrylate amount， types of adhesive agents with human sense as the evaluation index. Blank cataplasm matrix was optimized by the orthogonal experiment with the amount of glycerine， citric acid， and sodium carboxymethylcellulose as the major influential factors. Initial adhesive force， peeling strength and human sense were as the evaluation index. The optimized formulation of blank cataplasm were as followings： glycerine-water-ethanol-PEG400-dihydroxyaluminum aminoacetate-citric acid-sodium carboxymethylcellulose-sodium carboxymethylcellulose 2∶8∶0.8∶0.4∶0.07∶0.15∶0.1∶0.5. The active ingredients of white mustard seed， corydalis， and gansui root were extracted by alcohol extraction method. Asiasarum volatile oil was extracted by oil extractor. The optimized drug loading amount was 11% with initial adhesive force， peeling strength and human sense as the evaluation index. Asthma rats model were established by sensitized with ovalbumin and nose-scratching time as the evaluation index. High dose （17%） group of drug-loaded cataplasm had the obvious inhibition effect on nose-scratching time of rats （P=0.037<0.05）. In comparison， middle dose （11%）， low dose （4%） and positive-control groups had no obvious inhibitive effect on rats. White mustard seed cataplasm supplied a novel choice for anti-asthma therapy. And the overall pharmacodynamics assessment will be carried out on molecular level in near future.

[Key words] cataplasm; transdermal; asthma

doi：10.4268/cjcmm20142323