外源物质SNP,Spd对盐碱胁迫下射干幼苗伤害缓解作用的研究

重庆三峡库区植物生态与资源重点实验室， 重庆 400715）

[摘要] 为了盐碱地开发利用及射干的栽培管理提供理论依据，该实验通过外施外源物质SNP，Spd来缓解NaCl，Na2SO4，NaHCO3，Na2CO3 4种盐的摩尔比为9∶1∶9∶1，盐浓度为100 mmol・L-1的混合盐碱胁迫对射干幼苗造成的伤害，实验结果显示高pH胁迫是造成盐碱胁迫的主要因素，时间和各处理浓度之间有交互作用，盐，碱胁迫之间有协同效应。在100 mmol・L-1的盐碱胁迫下射干幼苗叶片中质膜过氧化指标（MDA，O-・2）和代谢产物（可溶性蛋白，可溶性糖，有机酸）的含量均呈现不同程度的上升趋势。经过不同浓度的SNP，Spd处理后，MDA和O-・2显著降低，并且有效提高了代谢产物的含量，其中SNP（0.05 mmol・L-1）和Spd（0.5 mmol・L-1）缓解伤害效果最佳。研究结果说明SNP，Spd能有效缓减盐碱胁迫对射干幼苗的伤害，提高射干幼苗的耐盐碱能力，从而为盐碱地的利用和射干种植提供科学基础。

[关键词] 盐碱胁迫;外源物质;射干幼苗;伤害缓解;生理生化指标

[收稿日期] 2014-05-27

[基金项目] 国家自然科学基金项目（30070080）

[通信作者] *何平，教授，博士生导师，Tel：（023）68254122，E-mail：

[作者简介] 徐梦平，硕士研究生，Tel：18883342571，E-mail：

射干Belamcanda chinensis （L.） DC.为鸢尾科多年生草本植物，是目前市场上紧缺的名贵中药材之一[1]。近年来发现射干耐盐碱，利用耐盐碱的植物对土壤盐碱化进行改良是在众多的生物措施中最为生态科学的[2]。选择耐盐碱的植物，了解植物的耐盐碱机制，以及怎样提高植物的耐盐碱性已成为当务之急，许多学者研究证明目前利用外源物质提高植物的抗逆性是一条非常有用的途径。本实验选用外源物质SNP，Spd对盐碱胁迫下射干幼苗进行恢复，以明确射干对盐碱胁迫缓解的适宜浓度，从而为盐碱地的利用以及射干开发与改良提供理论依据。

1 材料

供试的射干种子由河北安国胜利药材种子市场提供，经何平教授鉴定为B. chinensis的干燥成熟种子。Spd为Sigma公司生产，外源一氧化氮供体硝普钠（SNP）由韩国KAIST提供。

2 方法

每盆留长势整齐且健壮的4株幼苗，待其长至三叶一心时。选择经预实验证明的较为合适的浓度即 NaCl，Na2SO4，NaHCO3，Na2CO3 4种盐的摩尔比为9∶1∶9∶1，盐浓度为100 mmol・L-1溶液胁迫处理射干幼苗，并用SNP，Spd 2种外源恢复物质来做恢复实验，每种物质共设计6个处理梯度，包括空白对照组CK1、混合盐胁迫对照组CK2、不同浓度SNP处理组T1～T4，不同浓度Spd处理组T5～T8，见表1。每处理设置3个重复，每隔2 d向花盆内添加恢复液直到花盆里面的土淋透为止。分别在盐碱胁迫后第10，20，30天取样测定，测量O-・2，MDA，可溶性蛋白，可溶性糖时均称取0.3 g鲜叶用于酶液提取，测量3种有机酸时准确称取0.1 g干样进行HPLC的样品制备。

叶片中丙二醛（MDA）含量测定方法参照Velikova等的硫代巴比妥酸（TBA）检测法[3];用羟胺氧化反应测定O-・2含量[4];可溶性蛋白值采用张志良的方法测定[5];可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[6];高效液相色谱法测量幼叶及根中3种有机酸含量：岛津高效液相色谱仪（LC-20），草酸、柠檬酸、丁二酸对照品购于国家标准物质中心（HPLC≥98%）。色谱条件：Phenomenex C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为甲醇-NaH2PO4（3∶97），用磷酸

表1 对射干幼苗处理的不同组合

Table 1 Belamcanda chinensis seedlings treated by different combinations

处理NaCl-Na2SO4-NaHCO3-

Na2CO3（9∶1∶9∶1）SNP

/mmol・L-1Spd

/mmol・L-1

CK1000

CK210000

T11000.50

T210010

T31000.250

T41000.50

T510000.5

T610001

T710000.25

T810000.5

调pH至2.0;流速1.0 mL・min-1;每次进样量15 μL，检测波长210 nm;柱温25 ℃，使用前用0.45 μm滤膜过滤，超声脱气。在该色谱条件下进行草酸、柠檬酸、丁二酸含量的测定。

数据采用SPSS 19.0 软件进行重复度量和单因素方差分析。并用Duncan′s多重比较法检验每个生理指标（α=0.05）的差异显著性。文中图表均采用 Excel 2003软件根据SPSS分析结果制作。

3 结果与分析

3.1 外源物质SNP，Spd对盐碱胁迫下射干幼苗质膜过氧化物指标的影响

3.1.1 外源物质SNP，Spd对盐碱胁迫下射干幼苗叶片中超氧阴离子产生速率（O-・2）的影响 经过SNP处理后的射干幼苗，球形检验结果显示， P<0.05，不满足球形检验，进行自由度调整，主体内效应检验结果显示，各个时间点上的数据有统计学上显著差异（P<0.001）;时间和各处理浓度之间有交互作用（P<0.05），说明时间因素的作用随着各处理浓度的不同而不同;主体间效应检验结果显示，各处理浓度之间没有显著差异，即各处理浓度缓解盐碱胁迫下射干幼苗中超氧阴离子产生速率的作用不显著。

经过Spd处理后的射干幼苗，球形检验结果显示，P>0.05，满足球形检验，主体内效应检验结果显示，外源物质Spd处理后各个时间点上的数据有显著差异（P<0.001）。时间和Spd各处理浓度之间有交互作用（P≤0.001），说明时间因素的作用随着各处理组合的不同而不同;主体间效应检验结果显示，各处理浓度之间差异不显著。

由分析结果，经过盐碱胁迫后，超氧阴离子的产生速率与CK1相比呈现增加的趋势，但是随着时间的延长有下降的趋势，见图1。经过SNP处理后超氧阴离子的产生速率不同程度降低，其中第10天的时间点上各处理差异不显著，而在第20，30天时SNP各处理对超氧阴离子产生速率的影响差异显著（P<0.05）。其中当处理时间为30 d，处理浓度为0.5 mmol・L-1达到最低值44.272 μmol・g-1・min-1（FW）;经过外源物质Spd恢复处理后，也同样降低了超氧阴离子的产生速率，在第10天时影响不显著，但是在第20，30天的时候，Spd各处理对超氧阴离子产生速率的影响较显著（P<0.05），其中当处理时间为30 d，处理浓度为0.5 mmol・L-1达到最低值40.288 μmol・g-1・min-1，与CK2（54.916 μmol・g-1・min-1）相比差异显著（P<0.05）。

不同小写字母表示处理间有显著差异，P<0.05（图2～5同）。

图1 射干幼苗叶片O-・2的产生速率

Fig.1 The production rate in of O-・2 in the leaves of seedlings for Belamcanda chinensis

3.1.2 外源物质SNP，Spd对盐碱胁迫下射干幼苗叶片中丙二醛含量的影响 经过SNP处理后的射干幼苗，球形检验结果显示，P>0.05，满足球形检验，主体内效应检验结果显示，各个时间点上的数据差异不显著;时间和各处理浓度之间有交互作用（P<0.05），说明时间因素的作用随着各处理浓度的不同而不同;主体间效应检验结果显示，各处理浓度之间没有显著差异，即各处理浓度缓解盐碱胁迫下射干幼苗中丙二醛的作用不显著。

经过Spd处理后的射干幼苗，球形检验结果显示，P>0.05，满足球形检验，主体内效应检验结果显示，外源物质Spd处理后各个时间点上的数据差异不显著。时间和Spd各处理浓度之间有交互作用（P≤0.001），说明时间因素的作用随着各处理组合的不同而不同;主体间效应检验结果显示，各处理浓度之间差异不显著。

由分析结果得出，盐碱胁迫下射干幼苗叶片中丙二醛含量与空白对照相比出现前期和中期增加，后期降低，并且随着时间的延长出现先增加后降低的趋势，见图2。经过外源物质SNP恢复处理后，丙二醛的含量基本呈降低的趋势，在第20天时显著降低（P<0.05），但在第10，30天的时间差异不显著，并且当处理时间为20 d，处理浓度为0.05 mmol・L-1时降到最低值25.172 μmol・g-1（FW）与对照CK2（30.223 μmol・g-1，FW）相比差异显著（P<0.05）;经过Spd处理后与CK2相比，射干幼苗叶片中丙二醛的含量不同程度下降。其中在20，30 d时丙二醛含量显著降低（P<0.05），当处理时间为30 d，处理浓度为0.5 mmol・L-1降到最低值25.009 μmol・g-1。

图2 射干幼苗叶片丙二醛的含量

Fig.2 The content of MDA in the leaves of seedlings for Belamcanda chinensis

3.2 外源物质SNP，Spd对盐碱胁迫下射干幼苗代谢产物含量的影响

3.2.1 外源物质SNP，Spd对盐碱胁迫下射干幼苗可溶性蛋白质含量的影响 经过SNP处理后的射干幼苗，球形检验结果显示，P<0.05，不满足球形检验，进行自由度调整，主体内效应检验结果显示，各个时间点上的数据差异显著（P≤0.001）;时间和各处理浓度之间没有交互作用，说明时间因素的作用随着各处理浓度的不同而不同;主体间效应检验结果显示，各处理浓度之间差异显著（P<0.05）。

经过Spd处理后的射干幼苗，球形检验结果显示，P>0.05，满足球形检验，主体内效应检验结果显示，外源物质Spd处理后各个时间点上的数据差异显著（P≤0.001）。时间和Spd各处理浓度之间没有交互作用，说明时间因素的作用随着各处理组合的不同而不同;主体间效应检验结果显示，各处理浓度之间差异不显著。

由分析结果得出，在盐碱胁迫下可溶性蛋白的含量随着时间的延长呈持续上升的趋势，在后期的时候达到最大值，并且经过外源物质SNP，Spd进行恢复处理后，2个恢复效果出现相同的变化趋势，见图3。在第10，20 天时蛋白质含量差异不显著，但是在第30 天时差异显著（P<0.05）。SNP在处理时间为30 d，处理浓度为0.05 mmol・L-1时，叶片中可溶性蛋白达到最大值35.087 mg・g-1与同期对照相比差异显著（P<0.05）;Spd在处理时间为30 d，处理浓度为0.25 mmol・L-1时可溶性蛋白质达到35.941 mg・g-1与同期对照相比差异显著（P<0.05）。

3.2.2 外源物质SNP，Spd对盐碱胁迫下射干幼苗叶片中可溶性糖含量的影响 经过SNP处理后的射干幼苗，球形检验结果显示，P<0.05，不满足球形检验，进行自由度调整后，主体内效应检验结果显示，各个时间点上的数据差异不显著;时间和各处理浓度之间有交互作用（P≤0.001），说明时间因素的作用随着各处理浓度的不同而不同;主体间效应检验结果显示，各处理浓度之间差异显著（P<0.05）。

射干幼苗经过Spd处理后，球形检验结果显示，P>0.05，满足球形检验，主体内效应检验结果显示，外源物质Spd处理后各个时间点上的数据差异显著（P≤0.05）。时间和Spd各处理浓度之间有交互作用（P<0.05），说明时间因素的作用随着各处

图3 射干幼苗中可溶性蛋白质的含量

Fig.3 The content of soluble protein in the leaves of seedlings for Belamcanda chinensis

里组合的不同而不同;主体间效应检验结果显示，各处理浓度之间差异显著（P<0.05）。

由分析结果得出，盐碱胁迫下射干幼苗叶片中可溶性糖含量呈增加的趋势。经过外源物质SNP，Spd进行恢复处理后，可溶性糖的含量均有不同程度的变化，见图4。SNP第10，30 天时可溶性糖含量差异不显著，在第20天时差异极显著（P≤0.001）。其中SNP在处理时间为10 d，处理浓度为0.05 mmol・L-1时可溶性糖质量分数35.890 mg・g-1与盐碱胁迫对照CK2（35.581 mg・g-1）相比升高了，其余处理浓度效果不明显;Spd的各处理对可溶性糖含量的影响，在10，20 d的时候差异显著（P<0.05），在第30天时差异不显著。其中当处理时间为20 d，处理浓度为0.5 mmol・L-1时可溶性糖质量分数增加到最大值（34.022 mg・g-1，FW）与同期空白相比差异显著（P<0.05）。

3.2.3 外源物质Spd对盐碱胁迫下射干幼苗叶中、根中草酸含量的影响 外源物质Spd对盐胁迫下射干幼苗叶片中和根中草酸含量的影响，见图5。在叶子中和根中草酸含量变化的规律相似，即经过盐碱胁迫处理后幼苗叶片草酸的质量分数为0.111 mg・g-1（DW），根中草酸为0.113 mg・g-1（DW），分别与相对应的空白对照CK1（0.130，0.122 mg・g-1，DW）相比均增加了，但差异不显著。而不管是在叶片中还是在根中一旦经过不同浓度的Spd处理

图4 射干幼苗中可溶性糖的含量

Fig.4 The content of soluble sugarin of the leaves of seedlings for Belamcanda chinensis

后，与CK2相比较随着恢复浓度的增加呈现升高的趋势，并且当浓度为0.1 mmol・L-1以上时Spd使叶片中和根中草酸的含量呈逐渐增加的趋势，甚至当浓度为0.25，0.5 mmol・L-1时与空白对照CK1相比均达到差异极显著水平（P≤0.001），说明恢复效果比较好。

图5 射干幼苗叶、根中3种有机酸的含量

Fig.5 The content of three organic acids in the leaves and roots of seedlings for Belamcanda chinensis

3.2.4 外源物质Spd对盐碱胁迫下射干幼苗叶中、根中柠檬酸含量的影响 为外源物质Spd对盐胁迫下射干幼苗叶片中和根中柠檬酸含量的影响，见图5。经过盐碱胁迫处理后的幼苗叶片中柠檬酸的量（0.037 mg・g-1，DW）与空白对照CK1（0.032 mg・g-1，DW）相比显著的升高了（P<0.05）。而一旦经过不同浓度的Spd处理后，叶子中柠檬酸的含量与盐碱胁迫对照组CK2相比较均出现不同程度的降低趋势，而当浓度为0.05 mmol・L-1时柠檬酸的含量极显著的降低到最小值0.025 mg・g-1（DW）与空白对照形成极显著差异（P≤0.001）。而在根中经过盐碱胁迫CK2处理后柠檬酸的量（0.041 mg・g-1，DW）与根的空白对照CK（0.027 mg・g-1，DW）相比较，显著升高了（P<0.05），而一旦经过不同浓度的Spd处理后，与根中盐碱胁迫对照组CK2相比较均出现低浓度降低，高浓度升高的趋势，即当浓度达到0.1 mmol・L-1时开始随着浓度的增加柠檬酸的含量出现上升的趋势，并且当浓度为0.25 mmol・L-1以上时柠檬酸的含量与CK1，CK2相比均达到显著差异（P<0.05）。这说明通过Spd恢复处理能不同程度升高根中柠檬酸的含量。

3.2.5 外源物质Spd对盐碱胁迫下射干幼苗叶中、根中丁二酸量的影响 外源物质Spd对盐胁迫下射干幼苗叶片中和根中丁二酸含量的影响，见图5。经过盐碱胁迫处理后的幼苗叶片中丁二酸的量（0.038 mg・g-1 DW）与空白对照CK1（0.021 mg・g-1，DW）相比，显著升高了（P<0.05）。而一旦经过不同浓度的Spd处理后，叶子中丁二酸的含量与盐碱胁迫对照组CK2相比较均出现不同程度显著降低的趋势（P<0.05）。而在根中经过盐碱胁迫CK2处理后丁二酸的量（0.060 mg・g-1，DW）与根的空白对照CK1（0.048 mg・g-1，DW）相比较，含量升高，而一旦经过不同浓度的Spd处理后，出现中低浓度升高，高浓度降低的趋势，并且当浓度为0.05，0.1 mmol・L-1时与根中盐碱胁迫对照组CK2相比较显著升高（P<0.05），甚至恢复到显著高于空白对照的水平CK1（P<0.05）。

4 讨论

4.1 SNP，Spd恢复处理后射干幼苗质膜过氧化物产生指标的影响

乔枫、武敬亮等研究发现，盐碱胁迫下蚕豆幼苗[7]及黄连[8]体内MDA，O-・2含量会增加，这与本文的研究结果一致。本研究表明，射干幼苗在盐碱胁迫下发生了膜脂过氧化作用，且随着胁迫强度的增强而增强，这也与较高水平的MDA 和细胞组分进行反应相关联，它破坏了膜结构的同时也使一些酶遭到破坏，从而导致膜的选择透过性发生改变，打破细胞内的离子平衡状态，导致了代谢紊乱 [9-10]。

外源物质缓解植物在盐碱胁迫下受到的伤害至少有两方面原因：一方面是通过提高植株的抗氧化能力，另一方面是能调节植物体内离子平衡[11]，说明质膜发生的过氧化程度降低了，清除自由基能力增加从而维护了质膜的稳定性。本实验中经过外源物质SNPK，Spd处理后，射干幼苗叶片中超氧阴离子产生速率和丙二醛含量都降低，缓解了盐碱胁迫对细胞膜的伤害，维持了细胞膜的稳定性。这与近年来很多学者发现外源物质SNP，Spd能提高植物的抗逆性（抗盐碱性等）的研究结果一致。

4.2 SNP，Spd恢复处理后射干幼苗代谢产物的影响

在逆境条件下植物同时还积累其他的有机物，如可溶性糖、蛋白质和有机酸等。很多研究证明，有机酸是盐碱胁迫下的主要调节机制[12-13]。在本实验中，经过外源物质Spd处理后能有效提高射干幼苗草酸、和根中柠檬酸的含量，但是柠檬酸和丁二酸的含量在叶子中却下降了。这表明经过外源物质处理后，根部积累有机酸的量增加。这是由于根部是最先感应盐碱胁迫的部位，所以通过有机酸的大量积累来调节盐碱胁迫对植物造成的损伤，提高根对碱性环境的适应能力。施加外源物质后，射干幼苗通过积累有机酸来缓解盐碱胁迫造成的伤害，也再一次证明了有机酸代谢调节与植物的抗碱机制密切相关[14]。

综上所述，盐碱胁迫下SNP，Spd通过减缓O-・2的产生速率，降低MDA含量，提高了可溶性糖、可溶性蛋白、有机酸等的含量，从而提高了射干幼苗的耐盐性。

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Study on relieving effects of exogenous SNP，Spd on Belamcanda

chinensis under salt-alkalline stress

XU Meng-ping， HE Ping*， DUAN Cai-xu， YANG Mou

（School of Life Science， Southwest University， Key Laboratory of Eco-environments of Three

Gores Reservoir Region of Ministry of Education， Chongqing Key Laboratory of Plant Ecology and Resources

Research for Three Gorges Reservoir Region， Chongqing 400715， China）

[Abstract] The study is aimed to provide the theoretical basis for exploiting and utilization of salt-alkaline soil and cultivating Belamcanda chinensis. In this study， we exerted exogenous substances SNP， Spd to relieve the damage of the mixing salt-alkaline stress on B. chinensis seedling which is NaCl， Na2SO4， NaHCO3 and Na2CO3 four kinds of salt molar ratio of 9∶1∶9∶1， salt concentration of 100 mmol・L-1.The result illustrated that high pH stress is a major factor caused the salt-alkaline stress， the interaction between time and the concentration of each treatment was observed，what is more， there are synergies between the salt and alkali stress. The content of B. chinensis seedling leaves′ membrane peroxidation index （MDA， O-・2） and metabolites （soluble protein， soluble sugars， organic acids） are showing an upward trend in varying degrees under 100 mmol・L-1 salt-alkaline stress . It is effective to reduce the content of MDA and O-・2. and improve the levels of metabolites， in which the SNP （0.05 mmol・L-1） and Spd （0.5 mmol・L-1） to alleviate damage effects is the best. Therefore we can hold the conclusion that SNP and Spd can effectively mitigate the damage of B. chinensis seedling on sait-alkaline stress， improve the resistance ability of B. chinensis seedling which can provide the scientific basis for the utilization of salt-alkaline soil， and the cultivation of B. chinensis.

[Key words] salt-alkaline stress; exogenous substance; Belamcanda chinensis; alleviate damage; physiological and biochemical index

doi：10.4268/cjcmm20142315