新颖的基因治疗运载工具―AAV9脑内表达研究

摘要：基因治疗研究中显示血脑屏障是基因治疗中的最大障碍，目前多数基因载体需要复杂的手术进行脑内注射后进行目的基因在特定脑区的表达，本研究探讨AAV9作为新型基因运载工具在基因治疗的作用。结果显示尾静脉注射aav9后，AAV9可以高效的通过血脑屏障，同时诱导目的基因有效表达。AAV9病毒可以作为基因治疗的载体工具病毒。

关键词：AAV9；基因治疗；GFP；血脑屏障

迄今为止，大约有100%的大分子药物和98%的小分子没有办法通过血脑屏障，从而限制许多中枢神经系统药物开发工作。基因治疗作为遗传疾病治疗的另一种方法，需要将基因运送至中枢系统（大脑和脊髓）内，同样面临着血脑屏障的障碍[1]。根据大量中枢神经系统疾病的临床实验结果显示AAV载体能够持续将目的基因转运到目标脑区并稳定表达，同时安全性高，副反应小，但是该病毒载体需要通过脑部手术通过立体定位等方式注射到目标脑区，因此对于基因治疗研究来说急需一种能够外周给药后很好的通过血脑屏障，目标基因表达量高，同时生物安全比较高的基因运输载体。

AAV（腺相关病毒）分为2型，6型和8型目前研究中广泛使用，最近研究的发现AAV9，该型AAV具有强大的、多组织器官转导能力，全身静脉或腹腔内注射后AVV病毒能够在多种组织如骨骼、肌肉和心脏等器官内广泛表达。分子生物学研究显示AAV9能够有效地跨越血管内皮细胞障碍，然而该型病毒是否能够跨过血脑屏障并发挥载体运输的作用至今未知，本研究利用AVV9-GFP为载体，利用小鼠尾经脉注射AAV9检测其在中枢系统内的表达情况为AVV9[2]。

1资料与方法

1.1实验动物 20只C57BL/6小鼠（雄性）用于实验，体重22～30g，月龄8～12w，12h昼夜交换，湿度（22±0.5）℃，动物操作符合《徐州医学院实验动物操作和伦理委员会工作条例》。

1.2 AVV9病毒 AVV9病毒包装由山东唯真生物科技有限公司完成，由CMV做启动子建立GFP融合蛋白（AAV9-GFP），病毒滴度21012，qPCR检测病毒拷贝数用以确定病毒滴度。病毒使用1ml注射器进行小鼠尾静脉注射后，注射后动物返回饲养笼内，3w后进行灌流、荧光显微镜拍照。

1.3动物灌流 小鼠腹腔注射水合氯醛（4%）深度麻醉后进行脑组织灌流。暴露心脏形左心室主动脉插管进行0.9%生理盐水灌流（100ml）后进行4%多聚甲醛灌流，灌流需要缓慢滴注，待脑组织变硬再滴注15min多聚甲醛，剥离脑组织4%多聚甲醛过夜。第2d取出脑组织放入梯度蔗糖溶液脱水处理：蔗糖溶解在0.01M PBS（PH 7.2～7.5）配置成10%，20%和30%蔗糖溶液，从低浓度到高浓度，待脑组织沉底后更换下一个浓度蔗糖溶液。脱水处理后脑组织使用冰冻切片机（莱卡4510）进行冠状脑切片（30um）在-20℃冰箱保

1.4荧光显微镜成像 成像前脑组织置于室温复温15min，然后脑片中滴50ul PBS后在荧光显微镜下观察GFP蛋白表达。

2结果

小鼠经脉注射AAV9病毒3w后，经大脑灌流切片后发现多个脑区被AAV9感染具有GFP蛋白表达。我们发现运动皮层，听觉皮层，视觉皮层，体感皮层，内侧前额叶皮层，纹状体均有信号表达，说明小鼠经脉注射AAV9-GFP后，病毒能够透过血脑屏障感染神经系统，同时进一步分析显示AAV9不但能够过血脑屏障而且还可以稳定表达，脑内多个脑区均有融合GFP蛋白的广泛表达（图1）。

3讨论

我们的实验结果显示AAV9能够有效的通过血脑屏障，脑内运动皮层，听觉皮层，视觉皮层，体感皮层，内侧前额叶皮层，纹状体多个脑区能够稳定表达。该研究结果证实AAV9具有一种独特的能力就是穿过血脑屏障。注射AAV9-GFP后在众多脑区，我们发现神经元大量的转导在AAV9的运输中发挥重要作用。这些结果有理由为提供深入的病毒基因转移机制的AAV9为基础的载体[3]。以前研究显示的血脑屏障是保护大脑免受外界干扰侵袭的重要结构基础，同时也是基因治疗技术的一个障碍。实验动物研究显示，多种病毒载体能够介导基因在脑内表达，但几乎都是通过手术的办法将携带治病基因的病毒如AAV，慢病毒注射到目标脑区，这样的操作不但负责，而且在临床缺乏可操作性[4]，所以寻找一个高效通过血脑屏障同时又可以稳定基因表达的载体，我们的结果为该难题提供了一个可供参考的运载工具病毒。

参考文献：

[1]C.M.Weismann，J.Ferreira，A.M.Keeler，Q.Su，L.Qui，S.A.Shaffer，Z.Xu，G.Gao，M.Sena-Esteves，Systemic AAV9 gene transfer inGM1 gangliosidosis mice reduces lysosomal storage in CNS and extends lifespan[J].Hum Mol Genet 24（2015）4353-4364.

[2]J.M.Brito-Armas，J.Castro-Hernandez，M.Rodriguez-Diaz，R.Castro-Fuentes，[Non invasive gene therapy in neurological diseases[J].Rev Neurol 52（2011）603-617.

[3]M.Chuah，T.Vandendriessche，Gene therapy for hemophilia"A"and"B"：efficacy，safety and immune consequences[J].Verh K Acad Geneeskd Belg 69（2007）315-334.

[4]E.M.Donnelly，N.M.Boulis，Update on gene and stem cell therapy approaches for spinal muscular atrophy[J].Expert Opin Biol Ther 12（2012）1463-1471.