气相色谱质谱联用鉴定基于水酶法制备的虹鳟鱼骨油组分

摘要采用水酶法制备虹鳟鱼骨油，单因素分析法优化虹鳟鱼骨酶解的工艺条件，考察了料液比、pH值、酶解时间、酶解温度、加酶量5个因素对鱼油提取率的影响，采用气相色谱质谱联用 （GCMS） 技术对鱼骨油的脂肪酸组成和含量进行了分析鉴定。结果表明，在55℃、pH 7.5、酶解时间为3 h、料液比为1∶1、加酶量为2000 U/g的条件下，利用碱性蛋白酶提取的虹鳟鱼骨油中的油脂含量最高。GCMS分析结果表明，虹鳟鱼骨油中主要成分是不饱和脂肪酸，含量为脂肪酸总量的80.4% （w/w），其中单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸分别约占不饱和脂肪酸的76.9%和23.1% （w/w）， DHA和EPA的总量为3.4% （w/w）。本研究优化了虹鳟鱼油的提取技术，对虹鳟鱼油的主要挥发性物质进行了分析鉴定，初步确定了其中对鱼油风味起主要贡献的物质，对鱼油产品的分析与鉴别具有参考价值。

关键词鱼骨； 水酶法； 鱼油； 不饱和脂肪酸； 气相色谱质谱联用

1引 言

鱼类加工中产生的大量鱼骨副产物中富含蛋白质，目前主要的利用方式是将其加工成饲料，经济价值低。虹鳟鱼中含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质，长期食用能有效防止心血管类疾病，具有降血压、降血糖、降血脂的功效，被誉为“水中人参”＼[1＼]。鱼油是鱼骨中富含的主要功能性成分之一，其主要成分为Omega3脂肪酸，具有抗炎＼[2＼]、降血脂、预防心血管疾病＼[3，4＼]等作用，是一种具有良好功能的食品原料。

目前，生产鱼油的主要方法有蒸煮法＼[5＼]、淡碱液清洗法＼[6，7＼]、溶剂提取法＼[8＼]、水酶法＼[9，10＼]和超临界流体萃取法＼[11，12＼]。蒸煮法不能将与蛋白质相结合的脂肪分离，提取率较低，而且蒸煮温度一般为90℃，会对鱼油品质造成不良影响。淡碱液清洗法和溶剂提取法中溶剂不易回收，并可能造成环境污染。超临界流体萃取＼[13＼]主要是用于萃取含游离脂肪酸较高的成分，难以实现规模化及工业化生产＼[14＼]。相比之下，水酶法提取效率较高，能有效回收原料中蛋白质＼[15＼]，且不污染环境，表现出良好的应用前景。

不同来源的鱼油其脂肪酸组成存在很大差异。目前针对深海鱼类来源的鱼油脂肪酸组成分析的研究较多，但针对淡水鱼尤其是虹鳟鱼的鱼油的脂肪酸组成的研究却未见报道。本研究以虹鳟鱼骨为原料，采用水酶法制备鱼油，并采用气相色谱质谱联用（GCMS） 技术对虹鳟鱼油的脂肪酸组成及其风味进行了分析，为鱼油的检测分析及其开发利用提供了参考。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Atomx/7890B/5977A吹扫捕集气相色谱质谱联用仪 （安捷伦科技 （中国） 有限公司）；CF16RXⅡ高速离心机 （日本Hitachi公司）； PB10 pH计 （赛多利斯科技仪器 （北京） 有限公司）；TTLDC多功能氮吹仪 （北京同泰联科技术发展有限公司）；紫外分光光度计 （上海光谱仪器有限公司），NMI20030H1核磁共振仪（上海纽迈电子科技有限公司）；微波传感器 （上海福美斯电子科技有限公司）。

碱性蛋白酶 （173168 U/g）、风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶（北京宝希迪有限公司）；甲醇 （Methanol，色谱级）、正己烷 （Hexane， 色谱级）、Na2CO3、NaOH、CuSO4、酒石酸钾钠、钨酸钠、钼酸钠、Li2SO4等试剂（大连博诺有限公司）。Agilent 19091S433UI HP5ms Ultra Inert色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）。虹鳟鱼骨由山东悦一生物科技有限公司提供。

2.2蛋白质等组分含量测定

蛋白质测定采用Folin酚试剂法＼[16＼]，脂肪含量测定采用NMR法＼[17＼]，水分测定采用微波传感器法＼[18＼]，灰分测定采用灰化法＼[19＼]。

2.3鱼骨样品处理方法

鱼骨切碎成0.3 cm×0.5 cm的小块，按料液比1∶2 （w/w），加水搅拌均匀，高压蒸煮 （121℃， 30 min）。然后进行匀浆 （5000 r/min， 5 min），将匀浆液调节到适宜温度 （参照表1），用1 mol/L NaOH调至pH值，加酶 （500 U/g） 水解 3 h，100℃灭活酶10 min，10000 r/min离心20 min，取上层鱼油，待测。

鱼油提取率的计算公式为：

其中，鱼骨中所含鱼油质量即为粗脂肪含量，采用NMR法M行快速测定。

2.4蛋白酶的筛选

本研究选择5种蛋白酶水解虹鳟鱼骨，以鱼油提取率为指标确定最适合的酶，所选取的各蛋白酶水解条件如表1所示。

2.5脂肪酸组成分析

2.5.1样品甲酯化取0.02 g 酶解后的鱼油于样品瓶中，加入2 mL 0.5 mol/L KOHCH3OH，密封，60℃水浴孵育2 h。冷却至室温，用6 mol/L HCl调至pH 3～4；加入2 mL 正己烷萃取，重复3次，35℃下氮吹至恒重。加入0.5 mL色谱级正己烷，混匀，加入2 mL 1% H2SO4CH3OH，70℃水浴1 h，冷却至室温，用去离子水调至中性，静置分层后，移取正己烷层，加入无水Na2SO4，过夜，备用。

2.5.2气相色谱质谱联用分析GC条件：Agilent 19091S-433UI HP5ms Ultra Inert毛细管柱 （30 m×250 μm×0.25 μm）；载气：高纯氦气；分流比：50∶1；流速：1.0 mL/min；进样口温度：250℃；升温程序：柱箱初始温度50℃，保持1 min，以50℃/min 的速度升温至170℃，再以4℃/min升温至300℃，保持15 min；进样量1

SymbolmA@ L。

MS条件：EI离子源，电离能量70 eV，离子源温度230℃。通过检索NIST谱库，对脂肪酸进行定性分析，通过面积归一化法确定其相对百分含量。

3结果与讨论

3.1虹鳟鱼骨中主要成分含量

虹鳟鱼骨是一种高蛋白、高脂肪的原料，测得虹鳟鱼骨中蛋白质含量为15.9% （w/w），脂肪含量为17.7% （w/w）。

3.2鱼骨水解条件的优化

3.2.1水解蛋白酶的选择5种蛋白酶酶解提取鱼油的结果如图1所示，其中碱性蛋白酶酶解虹鳟鱼骨的油脂提取率明显高于其它酶，因此选择用碱性蛋白酶进行酶解，并对虹鳟鱼油的提取条件进行优化。

3.2.2酶解温度对鱼油提取率的影响如图2所示，温度升高，鱼油提取率逐渐增加，在55℃时达到最大。这是因为温度升高，酶的活力增强，酶解速率加快，当温度达到一定值后，随着温度的升高，酶逐渐失活，提取率下降；同时，温度过高会导致油脂品质下降。因此，选取55℃为酶解的最佳温度。

3.2.3酶解时间对鱼油提取率的影响如图3所示，酶解时间少于3 h时，油脂提取率随时间延长而增大；当酶解时间达到3 h后，油脂提取率增长速度变慢；同时，酶解时间延长，油脂中的不饱和脂肪酸容易氧化变质＼[19＼]，因此，选择3 h为虹鳟鱼骨酶解的最佳时间。

3.2.4pH值对鱼油提取率的影响在最适pH时，酶表现出最大活性，pH值过低或过高，都会使酶活性降低，甚至失活。如图4所示，随着水解体系pH值增加，鱼油提取率先增加后降低，在pH 7.5时，虹鳟鱼骨的油脂提取率到达最大值。因此本研究选择pH 7.5为鱼骨酶解的初始pH值。

3.2.5加酶量对鱼油提取率的影响如图5所示，随着蛋白酶加入量增加，鱼油提取率逐渐增大，酶加入量为2000 U/g时，提取率最大；当酶过量时，酶自身的水解增强，鱼油提取率反而降低＼[20＼]。本实验结果表明，2000 U/g为酶的最适加入量。由于酶加入量为500 U/g与2000 U/g时鱼油提取率的差别不大，考虑到成本，选取500 U/g进行后续实验。

3.2.6料液比对鱼油提取率的影响如图6所示，当料液比为1∶1时，油脂提取率最大，之后随着水加入量增加，提取率逐渐降低，这可能是由于水加入量增加，底物浓度降低，酶的浓度也减小，导致提取率降低。

综合上述实验结果，虹鳟鱼骨油的最佳提取条件为：在55℃、pH 7.5、酶解时间为3 h、料液比为1∶1、加酶量为500 U/g。在此条件下，利用碱性蛋白酶提取的虹鳟鱼骨中的油脂含量最高，提取得到的粗鱼油呈橘红色，油体清澈、透明，鱼油香味纯正。

3.3虹鳟鱼骨脂肪酸组成分析

将提取的虹鳟鱼油进行气相色谱质谱分析，所得谱图见图7，脂肪酸组成见表2。从表2可知，本研究测得的虹鳟鱼骨油中的脂肪酸共25种，主要在C12～C22之间。其中饱和脂肪酸7种，含量为总脂肪酸的20% （w/w）；其余为不饱和脂肪酸， 占脂肪酸总量的80% （w/w），单不饱和脂肪酸占不饱和脂肪酸的76.9%，多不饱和脂肪酸占23.1%，高于罗非鱼内脏的63.31% （单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸分别占脂肪酸总量的3813%和25.18% （w/w））。在不饱和脂肪酸中，含量最高的为油酸，其次为亚油酸。脂肪酸是风味化合物的重要前体，是挥发性化合物的主要来源。Caprino等＼[21＼]研究了

白鲟鱼的脂肪酸组成及其风味化合物，脂肪酸主要是棕榈酸和油酸，其次是DHA和EPA；主要风味化合物是醛类，占挥发性化合物的60%，对其风味起主要作用的己醛和壬醛是由亚油酸氧化形成的；庚醛和辛醛来源于油酸和亚油酸的氧化。龙斌等＼[22＼]以川鲶为原料，对其腹部和背部的脂肪酸及挥发性化合物进行测定。羟基化合物和羰基化合物是最重要的风味化合物，尤其是醛类，其中己醛、庚醛、辛醛、壬醛、2，5辛二酮、1辛烯3醇对川鲶的风味影响最为显著；大多数醛是不饱和脂肪酸氧化形成，其进一步氧化反应生成短链醛。该研究进一步验证了脂肪酸对挥发性风味化合物的形成至关重要。脂肪酸降解后能生成醛类、醇类、烷烃、烯烃等挥发性风味化合物。因此，本研究以提取的虹鳟鱼骨油为原料，采用SPMEGCMS对其挥发性化合物进行了测定。虹鳟鱼油中共检测出醇类占14.78%、烷烃34.23%、醛类28.05%、酮类1.96%、苯0.46%、吡嗪10.76%、酸0.63%、酯1.38%、烯烃6.36%、萘0.27%、炔烃1.49%等，其中，醛类、吡嗪是鱼油嗅感的主要物质。辛烯醛是导致鱼油产生腥味的最主要物质，它是一种重要的有机中间体，是生产丁辛醇、香料的重要中间体＼[23＼]。 醛类的气味阈值较低，是鱼油中的多不饱和脂肪酸在酶和微生物的作用下发生氧化降解而生成的＼[24＼]。在虹鳟鱼油挥发性化合物中，另一个含量较高的物质是N（2丙炔基） 吡咯烷，是由脂肪酸氧自由基均裂产生的，但由于其阈值较高，其对鱼油风味的形成直接贡献不大。在虹鳟鱼骨中检测出吡嗪类物质，包括2乙基5甲基吡嗪 （草味，坚果味） 和2，5二甲基吡嗪 （烘烤坚果味）＼[25＼]，其中2乙基5甲基吡嗪含量较高，占1.86% （w/w），在虹鳟鱼油的风味形成中起重要作用。

4结 论

本研究以虹鳟鱼骨为原料，采用水酶法提取鱼油，对提取条件进行了优化。GCMS的分析结果表明，水酶法所提取的鱼油中不饱和脂肪酸占绝大部分（80.4%），其中单不饱和脂肪酸占不饱和脂肪酸的76.9%，多不饱和脂肪酸占不饱和脂肪酸的23.1%， DHA和EPA占总脂肪酸的3.4%。本研究对~油产品的分析与鉴别具有参考价值。

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