狐狸尾兰组织培养体系优化

摘 要：狐狸尾兰是一种受到人们极度喜爱的兰科植物。由于采用种子及分株的方式很难在短时间内获得大量的种苗，远远不能满足市场的需求。目前已有学者研究了狐狸尾兰的组织培养技术，本研究在前人的研究基础上，本研究通过对不同条件下类原球茎体增殖倍数的研究，来明确培养基中各种成分的作用方式，最终得出如下结论：（1）液体培养基有利于类原球茎体短期的快速增殖，长期继代培养及保存类原球茎体时选用固体1/2 MS培养基适宜；（2）在培养过程中，施加1mg/L的BA的效果更优一些，及可以增加类原球茎体的数目，又不会引起玻璃化的产生；（3）在培养基中加入1.0g/L维生素C可以有效抑制外植体的褐化。

关键词：狐狸尾兰；组织培养；体系优化

1 前言

狐狸尾兰（ Rhynchos tylis gigantea） 又名钻喙兰、海南钻喙兰、狐尾兰， 为兰科钻喙兰尾多年生附生草本，其在野生环境下多附生于橡胶树、枫树或榕树上，是我国海南野生名优兰品种之一。狐狸尾兰叶片肥厚、翠绿，宽带状， 外弯，多有数条浅色的纵条纹，茎直立， 具数节， 不分枝。狐狸尾兰花序直立或呈下垂状，且花序多而密集；花瓣比萼片小；其唇瓣呈浅3裂或不裂状；距两侧压扁；蕊柱短，蕊柱足较短；花粉块2个，有不同程度的裂隙，呈蜡质状；具有狭长的蕊喙柄以及较小粘盘，花期通常在1～3月。狐狸尾兰的花色也较为丰富，有红、粉红、白、蓝、橘等颜色。由于其花型独特，花色丰富，花期长，且花期为我国传统春节前后， 是极好的新春贺岁花卉，因此受到人们的极度喜欢[1]。

然而，由于我国海南地区热带森林过量采伐， 致使野生狐狸尾兰的自然生境受到严重破坏， 加上人为的过度采集出售， 致使野生狐狸尾兰数量锐减，严重影响了狐狸尾兰生态群的构成。且由于狐狸尾兰的种子在自然条件下不易萌发， 采用种子繁殖很难获得后代，虽然可以采取分株方法， 但是这种方法不仅繁殖系数低，且繁殖速度非常慢， 远远不能满足市场的需求[2]。

目前，通过组织培养的技术来快速繁殖已在很多兰科植物普遍应用，比较常见的如蝴蝶兰、大花蕙兰等。在狐狸尾兰上，高宏秀等以狐狸尾兰未成熟种子作外植体， 应用组织培养等生物技术对狐狸尾兰类原球茎体诱导、增殖和催根进行研究[3]。本研究拟在前人的研究基础上通过方差分析探讨在狐狸尾兰组织培养的过程所需培养基的最佳条件，为狐狸尾兰工厂化育苗提供科学依据。

2 材料方法

2.1 外植体

取狐狸尾兰7～8成熟果实的种子为外植体。

2.2 方法

2.2.1 无菌材料的获得。参考高宏秀等的方法少有改动：用去离子水冲洗狐狸尾兰果实表面， 然后在超净工作台上用70 %酒精表面消毒果实1.5min ， 无菌水冲洗2 次， 再用无菌滤纸吸干水分，然后用解剖刀切开荚果， 取出细小种子， 轻轻将种子均匀散落到固体培养基上， 每平板接种量为50粒种子。

2.2.2 类原球茎体诱导。把狐狸尾兰的种子分别接种于诱导培养基中， 诱导原球茎（类原球茎体）的形成。培养基组成成分如下：VW +6-BA 1.0mg/L +NAA 0.15 mg/L。

2.2.3 培养方式的筛选。将诱导出的类原球茎体接种在1/2 MS培养基上，分别采用固体培养和液体转动培养2种方式，3次重复，每个处理接种20个三角瓶。4周后统计类原球茎体的增殖倍数（增殖倍数=新长出的类原球茎体/接种类原球茎体数）。

2.2.4 植物生长调节剂浓度的筛选。以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的BA、KT、IBA、NAA 4种生长调节剂，分别进行单因素试验，每处理3次重复，每个处理接种20个三角瓶。4周后统计类原球茎体的增殖倍数，计算方法同上。

2.2.5 不同添加物对类原球茎体褐化的影响。以1/2MS为基本培养基，在培养基中分别添加不同浓度的维生素C、活性炭（AC）和Na2S2O3。分别进行单因素试验，每处理3次重复，每个处理接种20个三角瓶。50天后观察并记录类原球茎体褐化和生长状况。

3 结果与讨论

3.1 培养条件对类原球茎体增殖的影响

在两种培养模式下的类原球茎体增殖倍数统计见表1。

由表1看出，液体1/2 MS培养基中培养的类原球茎体的增殖倍数极显著的高于固体1/2 MS培养基条件下的增殖速度。但同时也表现出固体1/2 MS培养基上的类原球茎体的外观表现较好，呈现出嫩绿色的外观，质地紧致。而在液体培养基中类原球茎体粒数多，颗粒大但组织结构较疏松，且严重玻璃化，丧失了分化能力，这与陈春满（2002）在象牙白花兰种子的组织培养研究结果类似[4]。因此，液体培养基有利于类原球茎体短期的快速增殖，一旦时间过长，将丧失分化能力。如果要长期继代培养及保存类原球茎体时选用固体1/2 MS培养基适宜。

3.2 植物生长调节剂浓度类对原球茎体增殖的影响

细胞分裂素种类和浓度的对类原球茎体增殖的影响结果见表2。

根据表2的结果，在结合我们前面的研究，可以看出细胞分裂素KT， BA都对类原球茎体的增殖明显的促进作用。表面上看，0.5mg/L的KT相对于BA的增殖效果更好一些，这样说明的了狐狸尾兰类原球茎体对KT反应较为敏感超过一定浓度，如浓度达到1mg/L或高于这个浓度，则会增加类原球茎体玻璃花的几率。因此，笔者认为1.0 mg/L浓度的KT相对于BA效果更好，说明此春兰的根状茎对KT更敏感，1mg/L的BA的效果更优一些。

3.3 不同添加物对类原球茎体褐化的影响

前人的研究认为活性炭、维生素C和Na2S2O3可以减缓或抑制培养物褐化[5]。在1/2MS培养基中添加不同附加物，并观察比较其对类原球茎体生长状况的影响。施加不同浓度Vc和Na2S2O3的培养基中类原球茎体褐化程度见表3。

从表3中我们可以看出：Na2S2O3没有有效抑制柳兰褐化，为了确认这一结果，笔者又对外植体进行了暗培养、接种前用Na2S2O3浸泡外植体等处理，均没有抑制柳兰褐化。这肯能使由于醌类化合物被外植体排到培养基中，从而抑制了植物体内的酶活性。不同浓度维生素C也有在一定程度上也能抑制褐化，不同浓度活性炭一定程度上也能抑制褐化，其原因可能是活性炭吸附了培养基中的有害物质。但由于活性炭在吸附有害物质时，也常常会吸收营养物质，因此，笔者推荐1.0g/L维生素C作为外植体褐化的抑制剂。除此之外，长时间继代培养可使培养物逐渐脱除酚类物质。

4 结论

根据我们的研究并结合前人的研究结果，我们对狐狸尾兰组织培养条件进行了优化研究，最终得出如下结论：（1）液体培养基有利于类原球茎体短期的快速增殖，一旦时间过长，将丧失分化能力。如果要长期继代培养及保存类原球茎体时选用固体1/2 MS培养基适宜；（2）在培养过程中，施加1mg/L的BA的效果更优一些，及可以增加类原球茎体的数目，又不会引起玻璃化的产生；（3）在培养基中加入1.0g/L维生素C可以有效抑制外植体的褐化。

参考文献

1 陈宇勒.图解狐尾兰之生活空间[J].花木盆景（花卉园艺），2003（10）

2 丁慎言，尹俊梅.海南岛野生兰花图鉴[M].北京：中国农业出版社，2005

3 高宏秀，尹兴芳.狐狸尾兰原球茎快速繁殖问题探讨[J].科技向导， 2012（29）

4 陈春满，叶一枝，凌绪柏.象牙白花兰种子及茎尖培养与原球茎形态发生[J].园艺学报，2002（3）

5 刘青林，马伟，郑玉梅.花卉组织培养[M].北京：中国农业出版社，2003